【科研摘要】

生物結構本質上是複雜的。結構層次，化學各向異性和組成異質性在生物系統中無處不在，並在生物系統的功能中發揮關鍵作用。幾十年來，諸如軟光刻的方法透過對2D分子圖案進行精確的空間控制，使得這種佈置得以再現。隨著技術的進步以及對分子和結構生物學的日益深入的理解，人們對以3D重建此類空間組織的興趣日益濃厚。最近，倫敦瑪麗皇后大學Alvaro Mata教授團隊在《先進功能材料》上發表了題為3D Patterning within Hydrogels for the Recreation of Functional Biological Environments綜述，作者介紹用於組織工程應用的水凝膠內功能分子的3D模式建立的最新技術的全面摘要。根據用於製造圖案的主要驅動力，將審查分為五組技術，包括光，精確的化學設計，微流體，3D列印和非接觸力（即電場，磁場或聲場和自部件）。

1介紹

1.1自然與生物系統的模式

大自然充滿了美麗的結構，展現出精確形狀和大小的重複圖案。但是，這些模式絕不僅僅是美學特徵，而是運動，繁殖，保護和營養的必要條件。例如，飛鵝顯示的美麗的V形圖案（圖1A）有助於羊群感知周圍環境並在整個群體中快速傳遞資訊。動物面板（例如長頸鹿，豹子或斑馬）上存在的黑色素斑點或圖案條紋的週期性，以及鳥類羽毛上的顏色梯度（圖1B）用作偽裝，訊號或識別。樹木在遇到外部因素（例如風，光，競爭者以及生物或非生物應激源）時，會以最小的能量消耗形成分支模式（圖1C）以保持其結構特性。這些美麗而實用的圖案是自然界演化出的精確空間組織的直接結果。

圖1 自然界中的圖案。

1.2需要重現結構和化學各向異性

模組化組織工程（TE）策略已被開發出來，透過從下至上製造活動的構建基塊來工程化組織和器官。實現圖案的需求和潛力並不是什麼新鮮事。 Whitesides及其同事在二十多年前開發的軟光刻技術已在細胞生物學，生物化學，生物技術和生物工程領域產生了巨大影響。這些示例說明了2D或2.5D地形線索可能會對研究或重建生物過程的能力產生影響（圖2A）。想象一下，如果能夠輕鬆地在複雜的3D環境中製造相似的圖案（圖2B），則可以想象。

圖2 從2D到3D仿生環境。

1.3綜述目的

在這裡，作者回顧了能夠在水凝膠中製造功能性3D模式的領先技術。作者將3D模式定義為在水凝膠內部定位的明確定義的生物功能異質性，賦予其空間定義的生化或結構特性。根據用於製造圖案的主要驅動力將審查分為五組技術，包括光，化學設計，微流體，3D列印以及涉及電場，磁場，聲場或自組裝的非接觸力（圖3）。

圖3 製作3D圖案的方法。

2透過照相製版製作圖案

光已被廣泛用於在水凝膠中產生圖案。光圖案化需要能夠在曝光後發生反應的部分（光敏或光敏）。將這一部分分為不同的多層圖案化技術，後者使用光同時建立圖案和凝膠（圖4A）和後凝膠化圖案技術，後者在凝膠化之後建立圖案（圖5A）。

圖4 透過光圖案化，多層圖案化技術製作圖案。

圖5 透過光圖案化，後凝膠化圖案化技術來製作圖案。

2.2建後模式

凝膠化後的圖案化需要包含反應性光敏部分的合成水凝膠（圖5A）。在此，根據模板掩膜的使用（例如，掩模光刻（MP）或直接鐳射光刻）來劃分凝膠化後的圖案化技術 （聚焦鐳射照射（FLI）和雙光子鐳射掃描光刻（TPLSP））（圖5B–F）。

2.2.1掩模光刻

使用透過軟光刻製造的母版的概念已擴充套件到MP中水凝膠的3D圖案化。透過使用掩模覆蓋暴露在水之下的水凝膠表面，選擇性照射的未掩模區域會發生光反應，從而形成結構和生化模式（圖5B）。

3透過精確的化學設計製作圖案

化學（生物）綴合反應，例如生物素-鏈黴親和素或酪胺-過氧化物的綴合，PEGygaltion，肽的綴合以及偶聯-點選反應已被廣泛用於生產細胞反應性材料。其中，點選化學已被證明是在溫和條件下以高效率和選擇性，高收率和無害副產物結合功能分子的強大工具。點選化學前體的正交性使其成為水凝膠合成（圖6A）和諸如細胞移植，藥物遞送，體外模型和治療等應用的可行候選者。

圖6 透過精確的化學設計製作圖案。

3.1基於PEG的水凝膠骨架

Anseth和他的同事首先提出了使用Click水凝膠來進行細胞包封和透過四臂PEG四疊氮化物和雙（二氟代環辛炔）雙功能化多肽之間的雙正交的Huisgen環加成法來製作圖案的方法。

3.2糖胺聚糖和基於蛋白質的水凝膠骨幹

4透過微流控技術製作圖案

體內ECM的生化和生物力學特性直接影響細胞行為。

4.1微流控

在過去的20年中，已經提出了多種使用微流體技術對水凝膠和細胞進行圖案化的方法。例如，在微腔裝置中，透過層流將Matrigel圖案化成200–500 µm寬的平板，方法是將多達五個入口通道組合在一起，從而實現生物分子的共培養和梯度洗脫。其他示例包括透過對流混合微流體裝置生成膠原蛋白梯度，原代造血幹細胞模式化，ECM成分和多個細胞模式化以重建腫瘤位（圖7A）。透過一種複雜的方法，透過向多個入口微流控晶片新增氣動閥，在功能上使20 µm水凝膠微纖維在空間上具有可調節的結構和化學特徵，從而在纖維內控制肝細胞和成纖維細胞的共培養組織（圖7B）。微流控已經成為一種通用且對細胞友好的圖案化技術，允許使用多種型別的水凝膠，同時允許使用流動來操縱細胞（圖7C）。

圖7 透過微流控制備圖案。

5透過3D打印製作圖案

在過去的五年中，對用於組織工程和生物工程的增材製造的興趣呈指數增長。油墨材料的多功能性和可調整性，可擴充套件性，微尺度精度和製造結構的堅固性使3D列印得以發展。

5.1模仿血管的3D列印模式

人造組織的功能取決於適當的可灌注脈管系統中細胞和ECM的組裝。為了實現這一目標，3D列印已經能夠使用犧牲性策略在水凝膠中製造類似血管的結構，以產生空心結構。利用明膠的熱敏特性，該方法已被用於在膠原蛋白和纖維蛋白水凝膠中列印1 mm寬的犧牲明膠圖案，從而產生了內皮化的可灌注血管樣網路。同樣，熱敏性Pluronic F127已被用作GelMA中的犧牲材料來工程化血管系統（圖8A），印刷的瓊脂糖纖維已被用作犧牲品，以將類似血管的圖案生成各種水凝膠（圖8B）。無需犧牲策略即可製造類似血管的結構。例如，在非犧牲方法中，透過使微流體裝置適應3D印表機，用單個或兩個生物分子對GelMA血管網格進行構圖（圖8C）。

圖8 透過3D打印製作圖案。

6透過非接觸力製作圖案

電場，磁場和聲波以及自組裝的相互作用也可以用作操縱力，以設計3D環境中特定生物功能線索的模式。

6.1電圖案

6.2磁光成像

磁力還可用於在3D環境中動員和定位提示和單元。例如，將磁性標記的人類黑素瘤M1和成纖維細胞一起培養，並透過銷釘固定器和磁體專門定位以模仿腫瘤環境。

6.3助聽器

聲光止血技術最近已被用作一種清潔（即遠端控制）的技術來生成複雜的細胞模式。該技術利用細胞與周圍流體之間的密度差異，促進細胞向壓力最小的聲波節點平面遷移。類似地，法拉第波施加到纖維蛋白水凝膠上，促進了iPSC衍生的心肌細胞形成多個20 µm厚的層，超聲駐波在空間上將水凝膠內120-150 µm寬的成肌細胞群體組織在一起。後來的研究還證明了生產機械各向異性支架的可能性（圖9E）。類似地，採用超聲波體聲波將藻酸水凝膠中的hADSC優先排列成條紋狀。透過在過程中使用七邊形聲鑷實現對定位，方向和圖案几何形狀的更高控制，該鑷子用於在自由水凝膠中的DRG共培養物中建立多種型別的雪旺細胞圖案（圖9F）媒體。

圖9 圖案形成的非接觸力。

6.4透過自組裝進行構圖

自組裝提供了使用非共價力（即氫鍵，疏水相互作用，π–π堆積）從下往上生長，包括具有圖案的3D水凝膠的可能性。這種方法之所以特別有吸引力，是因為它為製造和建立細胞和亞細胞大小尺度的結構和化學模式提供了機會，從而促進了材料-細胞相互作用的最佳化。此外，自組裝還可以自發地建立具有奈米級精度和受控分子表示的圖案，而無需外部力。例如，在液-液介面處產生的疏水力已被用來引導PEG微凝膠組裝成線性，分支或偏移的聚集體，從而支援成纖維細胞的包封（圖9G）。

參考文獻：doi.org/10.1002/adfm.202009574