撰文丨十一月
責編丨酶美
腫瘤中細胞種群的詳細發育過程可以對癌症進展中的關鍵事件發生比如轉移擴散過程的時間和過程進行表徵。腫瘤進展過程的從包括早期獲得致癌突變到正常和惡性腫瘤細胞的轉化以及轉移定植到遠處的組織之中、原發腫瘤與轉移灶之間的關係以及最終適應性治療方案等過程中的每一步都會留下清晰的系統發育特徵。轉移是研究癌症進展過程中一個特別關鍵的步驟，因為它是癌症相關死亡率的主要原因【1】。然而，由於轉移時間本身是罕見、短暫並且隨機發生的，想要進行實時監測是一件極具挑戰性的任務。
為了能夠對腫瘤轉移過程進行分析和記錄，美國加州大學舊金山分校Jonathan S. Weissman研究組、Trever G. Bivona研究組以及加州大學伯克利分校Nir Yosef研究組合作在Science發文題為Single-cell lineages reveal the rates, routes, and drivers of metastasis in cancer xenografts，透過建立一種基於Cas9的單細胞譜系追蹤的技術對肺癌異種移植小鼠模型中的轉移率、轉移途徑以及轉移的驅動因素進行研究。
對於腫瘤轉移過程的關鍵特徵比如對轉移的克隆性、時間、頻率以及轉移起源以及目的進行研究研究需要透過準確重建腫瘤和轉移的系統發生樹【2】。而譜系追蹤技術正是為人們繪製相關細胞的譜系圖，為探索生物過程如癌症進展和轉移的系統發育原理提供了重要工具。經典的譜系追蹤策略可以從腫瘤亞群的共享序列變異模式中推斷出腫瘤祖先。但是這些傳統的細胞譜系追蹤的方式會受到自然突變數量的限制並且由於腫瘤取樣、測序誤差以及不同程度的腫瘤內異質性以及非中性突變的影響導致分析的準確性不足。
而最近一些關於基於Cas9的單細胞RNA測序細胞譜系追蹤的技術為大規模、高精度研究腫瘤進展提供了可行的方案【2-4】。簡單來說，Cas9切割特定的基因組位點，此處可以簡稱為“Target Site”，造成一個穩定的Insert/deletion（Indel）等位基因可以被後代細胞繼承，隨著細胞分裂，它們在其他部位積累更多Cas9誘導的indels，從而進一步區分連續的細胞分支。在譜系追蹤實驗結束時，透過測序從單個細胞中收集indel等位基因並與細胞狀態的單細胞表達譜配對。然後利用回溯性追蹤的計算方法重建系統發育樹，對測序得到的indels進行亞克隆細胞關係進行建模（圖1）。
圖1 基於Cas9的細胞譜系追蹤技術工作原理
根據這一思路，作者們建立了用於小鼠肺癌外植體轉移過程追蹤的Cas9細胞譜系追蹤技術。該系統主要包括以下幾個組成元素：1）用於實時成像的熒光素酶；2）產生遺傳indel的Cas9；3）記錄譜系資訊目標位點的10個獨特的條碼副本，可透過單細胞RNA測序捕獲表達轉錄本；4）3個sgRNAs引導Cas9到靶位點，從而開始譜系記錄（圖1）。
透過該方法作者們對小鼠肺癌外植體的細胞進行亞克隆細胞追蹤，隨後對測序結果進行重建系統發育樹。作者們發現樣本中系統進化距離和等位基因距離之間是一致的而且重建系統發育樹準確地模擬了細胞間的系統發育關係。進一步地，作者們透過重建的系統發育樹對轉移過程進行推斷和定量化的分析。另外，作者們希望對不同轉移能力下的單細胞轉錄狀態進行探究。透過比較匹配的轉錄本以及細胞譜系資料庫，作者們發現不同轉移行為對應著不同的基因表達，其中發現了很多已知與轉移過程相關的基因也有一些在轉移過程中未知功能的基因（圖2）。這些被識別的基因可以驅動腫瘤侵襲性的產生，透過進一步地遺傳操縱以及體外侵襲實驗，作者們發現了KRT17意想不到的在體外和體內抑制轉移表型的功能。
圖2 與轉移過程相關的基因
總的來說，作者們的工作建立了基於Cas9的細胞譜系追蹤技術，為加深對腫瘤的傳播和進展過程的理解提供了重要工具，同時為癌症生物學研究的其他方面提供重要資訊。另外，其中發現的一些腫瘤轉移驅動基因也為了解這些基因在腫瘤轉移過程中的作用以及建立相應的臨床治療方案提供了線索。在癌症之外，該方法也為系統發育的基礎研究提供了前所未有的解析度和規模，大大增強對於系統發生過程的理解。
原文連結：
https://science.sciencemag.org/content/early/2021/01/21/science.abc1944.full
製版人：十一
參考文獻
1.Chaffer, C. L. & Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science (New York, N.Y.) 331, 1559-1564, doi:10.1126/science.1203543 (2011).
2. Birkbak, N. J. & McGranahan, N. Cancer Genome Evolutionary Trajectories in Metastasis. Cancer cell 37, 8-19, doi:10.1016/j.ccell.2019.12.004 (2020).
3. Frieda, K. L. et al. Synthetic recording and in situ readout of lineage information in single cells. Nature 541, 107-111, doi:10.1038/nature20777 (2017).
4. Alemany, A., Florescu, M., Baron, C. S., Peterson-Maduro, J. & van Oudenaarden, A. Whole-organism clone tracing using single-cell sequencing. Nature 556, 108-112, doi:10.1038/nature25969 (2018).