為理解與人類疾病相關的遺傳因素，人類基因組計劃（HGP）和從患病個體獲得的DNA序列資料為此提供了前所未有的機會。癌症中的突變可能改變許多分子活動，而其中一個分子活動就是蛋白質磷酸化。當它被改變時，可能會導致整個系統的受損和訊號轉導的失調。迄今為止，已知有3000多種人類基因的改變與疾病相關。單基因疾病，例如亨廷頓氏病，囊性纖維化，地中海貧血和鐮狀細胞性貧血，都是由單基因突變引起的。而癌症和糖尿病等多因素疾病是由多個基因突變與環境條件之間的相互作用引起的。目前有許多已知的突變是自發的或體細胞氨基酸替換的，其中一些可能會對蛋白質功能有著巨大影響。在這些突變集合中，我們期望能觀察到阻斷正常分子功能的功能喪失性突變，以及功能獲得性突變，也就是與正常的相比，這種影響分子功能的突變能引起失調的啟用。最後，我們期望能觀察到許多並不參與腫瘤發生和發展的突變。氨基酸的絲氨酸殘基（Serine），蘇氨酸殘基（Threonine）和酪氨酸殘基（Tyrosine）的磷酸化在癌症相關蛋白中是非常常見的，並且已知在癌症中失調。眾所周知，磷酸化訊號傳導的變化可能是由於激酶和磷酸酶功能的失調，一般是透過改變基因表達來進行檢測。激酶或磷酸酶上的氨基酸替換直接破壞激酶或磷酸酶的穩定性和/或功能，導致靶磷酸化的改變。激酶或磷酸酶調節劑同樣也有引起磷酸化改變的作用。磷酸化位點的破壞是與癌症相關的，例如細胞週期蛋白D1（CCND1）中T286的突變。GSK3B在細胞週期蛋白D1的野生型中對T286進行磷酸化以啟動其核輸出，並隨後在細胞質中降解，而磷酸化的喪失與細胞週期蛋白D1在食管癌中的核積累有著因果關係，並通常會增加致癌風險。在涉及肝癌的連環蛋白β-1的另一項研究中，已知磷酸化發生在氨基酸T41和S45上，並導致顯著的磷酸化喪失。因此，磷酸化靶位點突變是癌症發展的新途徑。癌症中訊號轉導失調的機制是透過去除或產生磷酸化位點來介導的，從而導致磷酸化功能的喪失或獲得，這取決於磷酸化殘基的作用。我們可以發現幾種富含磷酸化破壞突變的通路。值得注意的是，Wnt/β-連環蛋白通路富含磷酸化位點的獲得以及喪失的活動。磷酸化可以以各種形式影響蛋白質功能，例如增加或減少蛋白質的活性、穩定它或將其標記去被破壞、將其定位在特定的細胞區室內，並且可以啟動或破壞其與其他蛋白質的相互作用。人類基因組編碼的21,000種蛋白質中，超過三分之二被磷酸化，且可能有90%以上的蛋白質受到PTM的影響。因此，磷酸化活動在控制生物程序如增殖，分化和凋亡中起重要作用。蛋白質的磷酸化位點通常具有關鍵的調節功能，並且是許多細胞訊號傳導通路的核心，因此修改它們的突變有可能導致病理狀態，如癌症，心血管疾病，腎臟疾病等。而磷酸化位點調節的重要性可能存在巨大差異。磷酸化位點的突變有可能透過上調或下調該位點磷酸化的化學計量來極大地影響蛋白質的結構和功能。此外，突變的磷酸化經常修改進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）的成員，這種修改是許多細胞訊號傳導通路的核心，而另一個重要的考慮因素是破壞或改變其PPI以及整個PPI網路上磷酸化位點的影響。分子相互作用網路的研究已越來越多地應用於人類疾病，例如癌症，許多已知的癌症突變的影響可透過其對分子相互作用網路的影響來理解。

應用範圍：

在系統層面上研究蛋白質磷酸化的潛在領域。

1. 基礎研究：研究磷酸化調節譜（識別相關和相反訊號狀態的分子指紋分析）。

2. 疾病建模：使用基因處理工具構建細胞和動物的疾病模型（研究同基因背景下疾病相關基因中靶向突變的功能分析，研究疾病的病理及其發展）。

3. 基於細胞/基因的療法：基因藥物作為與缺陷基因相關的疾病可以在基因組層面上得到修正（人類治療和細胞治療的基因編輯）。

4. 藥物發現：細胞蛋白質內的磷酸化位點及其調節作用允許使用磷酸化作為測定終點，並且獲得的資訊可用於藥物發現和藥物開發過程中的各個階段。

基因編輯開拓了改善人類健康的新方向

CRISPR作為對基因組序列提供精確，有針對性的修改和校正的技術，基因組藥學被證明具有作為針對人類疾病的治療干預的廣泛前景。此外，使用CRISPR/Cas9技術，基因組的編輯變得簡單，因此可以在體內和體外更有效地製備和分析磷酸化位點的“敲入”點突變。

案例分析1：

使用CRISPR系統研究單基因肝病

威爾遜氏病（Wilson's disease, WD）作為單基因肝病是基於ATP7B基因的突變而產生的，並導致肝臟中銅（Cu）排洩的功能惡化。過量的銅積累在各種器官，例如肝臟和大腦。威爾遜氏病患者表現出臨床異質性，涵蓋了從急性或慢性肝衰竭到神經系統症狀。透過鋅或螯合劑的終生治療可以改善病程，但是在相當一部分患者中觀察到嚴重的副作用，例如神經功能惡化和腎毒性，因此肝移植將是不可避免的。另一種治療方案則是ATP7B基因的基因校正。在這項研究中，研究人員使用CRISPR/Cas9基因編輯在人類細胞系中引入人工ATP7B點突變，並透過額外使用的單鏈寡核苷酸（ssODNs）來糾正這一突變，模擬威爾遜氏病點突變在體外的基因修正。

ATP7B敲除細胞（HEK293TΔC）表現為胞嘧啶核苷酸缺失（紅色“-”標記）的點突變。Cas9在PAM區域（標藍）上游切斷三個核苷酸（紅色箭頭標記）。修復ssODN在位置1、2和3（ssODN_3M）或位置2和3（ssODN_2M）包含沉默阻斷突變。

用pmaxGFP脂質轉染HEK293TΔC細胞。GFP表達水平顯示在圖3A中。對攜帶阻斷突變2號（虛線框）的ATP7B修復的純合HEK293TΔC細胞克隆（黑色框）（圖3B）和攜帶所有三個阻斷突變（虛線框）的ATP7B修復的雜合HEK293TΔC細胞克隆（黑色框）（圖3C）進行Sanger序列分析。

這些實驗資料證明了CRISPR/Cas9介導的ATP7B點突變校正是可行的，並且有發展臨床使用的可能。

案例分析2：

使用CRISPR/Cas9校正HCT-116細胞中的β-cateninΔTCTser45的缺失突變

結直腸癌是第三大常見癌症。CRC與Wnt/β-catenin（β-連環蛋白）訊號傳導通路的失調密切相關。β-catenin在Ser45被酪蛋白激酶1（CK1）磷酸化，並連續在Ser33，Ser37和Thr41被糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）磷酸化，從而引起隨後的泛素化和蛋白酶體降解。這些Ser/Thr殘基的突變會改變重要的功能性磷酸化位點，抑制β-catenin磷酸化降解級聯反應，並導致Wnt/β-catenin訊號通路的組成性啟用。因此，透過基因編輯技術校正β-catenin基因突變可以開發用於結腸癌的新一代治療方法。在該研究中，人結腸直腸細胞系HCT-116被選用，因為它具有β-catenin基因的雜合缺失突變（ΔTCT），其負責在蛋白質的N-末端區域編碼調節性Ser45。研究人員透過基因測序證實了ΔTCTSer45缺失突變在β-連環蛋白基因的外顯子3和CRISPR/Cas9 PAM位點上的位置。96 nt ssODN包含了作為HDR修復模板的野生型β-catenin基因序列。將HCT-116細胞與載體和ssODN共轉染後，透過FACS篩選GFP陽性細胞並擴增，並透過TA克隆和測序計算突變校正效率。

由於該基因的一個等位基因中的缺失突變，HCT-116細胞中β-catenin的測序圖譜顯示從突變基因座開始的重疊峰（圖1C）。突變校正後，我們發現突變基因座中存在TCT序列，因此從突變基因座開始的重疊峰也相應消失了（圖1D）。這些發現證實，用Cas9-GFP/sgRNA共表達載體和ssODN共轉染可以糾正HCT-116細胞中的β-cateninΔTCTser45缺失突變。

β-catenin的Ser45是重要的磷酸化位點。ΔTCT密碼子的缺失突變將對HCT-116細胞中的β-cateninSer45磷酸化產生巨大影響。因此，研究人員研究了缺失突變體和被校正突變體中β-catenin的表達水平。如預期的那樣，與沒有β-cateninΔTCT缺失突變的DLD1大腸癌細胞相比，未校正的HCT-116細胞具有非常弱的可檢測Ser45磷酸化β-catenin表達（圖2A）。他們還研究了對照組和一個突變校正的HCT-116細胞克隆中的蛋白質表達，即總體、核和細胞質的β-catenin水平（圖2B）。此外，他們還比較了蛋白質的表達以及E-cadherin（E-鈣粘蛋白），c-myc，cyclinD1和survivin基因（圖2C，D，E和F）。

總的來說，透過CRISPR/Cas9和ssODN的組合去校正驅動突變可以極大地改進癌細胞系的生物學行為，同時也表明該方案在癌症的基因治療中的潛在應用。

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