對全腦神經解刨構架的透徹研究，對於理解大腦細胞組成，細胞連線和工作機制是至關重要的。然而，現有的全腦成像技術面臨這一個這樣的挑戰，即在全腦範圍觀察神經元精細結構時，如何同時保證高對比度（低背景）和高通量。

在常規寬場成像中（如光片成像，block-face方法），成像層會受到來自非成像層的熒光干擾。以往，解決策略是透過共聚焦，雙光子等方法規避這種干擾，然而由於其點掃描的特性，又會大大降低成像速度和通量。

近日，華中科技大學團隊合作，建立了化學選擇的熒光斷層成像技術（chemical sectioning fluorescence tomography, CSFT），解決了這一困擾神經科學家的難題。

CSFT基本原理

簡單來講，CSFT透過僅讓組織最頂層蛋白髮光，結合fMOST成像方法（fluorescence micro-optical sectioning tomography)，實現在高通量成像中的排除背景干擾。

帶有GFP熒光蛋白的鼠腦在酸性包埋介質中，此時酸性環境會讓GFP淬滅，熒光蛋白處於“OFF”狀態。然後將其置於鹼性緩衝液中，結合fMOST成像技術，切片露出成像層，成像層表面和緩衝液接觸，只有這薄薄一層熒光蛋白恢復熒光，回到“ON”的狀態，下層蛋白仍處於“OFF”狀態，因此可以得到很乾淨的背景和高對比度。這一層成像結束後被切掉，露出接下來的成像層，重複直至完成全腦成像。

圖1 CSFT原理

結果展示

研究者接著利用Thy1-GFP/YFP轉基因小鼠測試這一成像體系。在解析度方面，60倍鏡下最高橫向解析度可達0.116 * 0.116 mm2，可以清晰的看清神經纖維。在穩定性方面，全腦成像過程中訊號強度和質量沒有明顯改變。研究者還利用病毒測試了特異性神經元類別的成像，在錐體神經元，PV+神經元成像結果中，都可以很好地辨認其特徵結構。

圖2 Thy1-EGFP-M小鼠全腦CSTF成像

成像解析度和質量是三維重構效率和可行性的關鍵。研究者用CSFT重構軀體感覺皮層椎體神經元，在結果中，不論在長投射軸突區域還是附近軸突區域，所有35個椎體神經元都被完整還原。說明CSFT適用於全腦單個神經元，以及全腦單個神經元連線組研究。

圖3 椎體神經元三維重構

接著研究者證明CSFT在多色成像任務中也表現優良。透過最佳化包埋介質和熒光蛋白篩選，研究者又找到三種適用於CSFT方法的熒光蛋白（mClover3, pHOran4, mKate FPs），其可以和GFP結合使用，滿足全腦多色成像的需要。

最後研究者測試了CSFT在單細胞水平上定量研究神經元亞細胞結構的表現。使用CSFT錐體神經元單細胞成像的資料，長投射軸突，樹突棘和軸突結等結構都可以被識別。

總結

華中科技大學團隊建立的CSFT技術可以同時保證高通量和高解析度，大大推進了體外全腦成像，其和三維重構，多色熒光蛋白以及神經元結構分析良好的結合將在未來進一步推動神經科學的發展。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.108709

校審：Simon（brainnews編輯部）