細胞週期失調是癌症的經典特徵，會導致細胞無限制增殖。因此，研究人員對此過程開展了廣泛研究，希望開發出有效的治療方法。人們大多采用流式細胞術，透過DNA結合染料對細胞週期進行監控。

選擇合適的染料

Hoechst、DAPI和PI（碘化丙啶）等經典染料目前仍然廣泛用於細胞週期的分析，但也湧現出一些新型的染料。這些染料具有較窄的發射光譜和較低的細胞毒性，讓人們在設計流式實驗時具有更大的靈活性。

Abcam的資深科學家Saeeda Bobat博士稱：“DNA結合染料的作用原理在於它們是化學計量的。這意味著它們的結合與每個細胞中的DNA數量成正比。目前的染料包括：單嵌入劑（如PI）、雙嵌入劑（如YOYO）和小溝結合染料（如DAPI）。選擇哪種DNA結合染料，在很大程度上取決於實驗的設定和目的。”

安捷倫的流式應用開發科學家Lauren Jachimowicz解釋說，染料對DNA的特異性非常重要，並舉例說明了PI在細胞週期分析中的應用。“由於PI與所有核酸結合，因此染色緩衝液中應包含RNase A，以降解存在的RNA，”她說。在某些情況下，染料的選擇受到DNA序列的影響。例如，DAPI優先結合富含AT的區域。

Jachimowicz認為：“在選擇DNA結合染料時，另一個要考慮的因素是固定劑的型別。對於細胞週期分析而言，乙醇固定優於甲醛固定，因為甲醛誘導的交聯會破壞染料與DNA的結合。不過，如果你打算對其他目標進行染色，則需要確認準備使用的抗體和熒光染料是否與乙醇固定相容。”

開發出適用於活細胞研究的染料是DNA染色的重要進展之一。Bobat表示：“活細胞染色的優勢在於，它可以根據DNA含量對細胞進行分選，然後再進行下游處理。儘管目前只有諸如Vybrant™ DyeCycle™染料的新一代產品能夠做到，但在活細胞上開展細胞週期分析，這種能力讓人們有望實現更長期的研究。”

與其他標誌物相結合

正如前文所述，利用流式細胞術分析細胞週期的同時還需要監控DNA以外的其他靶點。“如果要分析異質性細胞群，而不是細胞系，則必須對其他引數進行染色，”Bobat談道。“例如在免疫表型分析中，你也許想鑑定中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞的亞群，並分別測定其DNA含量。”

“另外，你可能想比較靜息（G0）和增殖（G1）細胞，它們在DNA含量上無法區分。這時可以將DNA分析與細胞週期標誌物的染色結合起來，比如對細胞週期蛋白D1和E進行染色（靜息細胞為陰性），或者利用Pyronin Y來監控RNA水平（靜息細胞的RNA表達下調），”Bobat補充說。另一種常見做法是對磷酸化的組蛋白H3進行染色，以區分M期和G2期的細胞。

對於流式實驗而言，精心最佳化的實驗方案是至關重要的。一些久經考驗的最佳做法能避免doublet，因為如果兩個處於G1期的細胞同時透過鐳射，它們可能會被誤認為是G2期或M期的單細胞。

Bobat表示：“在染色之前可透過尼龍網濾器來過濾細胞，從而去除細胞團塊。此外，為了確保單細胞懸液，可在樣本緩衝液中加入EDTA以減少細胞間的粘附，同時避免劇烈的離心。”當分析以高流速進行時，發生doublet的可能性會增加，因此他建議適當減慢流速，儘管這會增加分析時間。

Jachimowicz認為：“透過對前向散射高度（FSC-H）和前向散射面積（FSC-A）作圖，可以排除doublet。與手動設門分析相比，基於軟體的自動化分析可提供更準確的資料解釋，但需要選擇正確的模型。自動化分析的兩種主要演算法是Watson Pragmatic和Dean-Jett-Fox（DJF）。安捷倫的NovoExpress軟體可同時提供這兩種演算法，並自動適應正常和複雜的S相分佈。”

成像流式細胞術

儘管流式細胞術已被公認為是細胞週期分析的金標準，但成像流式細胞術最近在這一領域也得到了廣泛的應用。ChemoMetec的研發負責人Søren Kjærulff博士認為，其主要原因是成像流式細胞術能夠將細胞DNA含量的定量與形態的鑑定結合起來。利用成像流式細胞儀來觀察DNA以及多個標誌物的亞細胞定位，研究人員能夠獲得更多的線索，而不會影響單細胞分析能力。

“成像流式細胞術將光學顯微鏡和流式細胞術的優勢融合在一起，”他說。“雖然光學顯微鏡是一種強大的技術，但它要求將細胞附著在固體表面，因此限制了可分析的細胞數量。相反，流式細胞術可以分析懸液中的大量細胞，但會丟失空間背景。透過成像流式細胞術來進行細胞週期分析，研究人員可快速分析大量細胞，並根據形態學結果進行證實。”

養細胞要用好血清！