揭示生物學樣本和材料樣本原本無法觀察到的內部結構

冷凍斷裂是一種將冰凍樣本劈裂以露出其內部結構的技術。冷凍蝕刻是指讓樣本表面的冰在真空中昇華，以便露出原本無法觀察到的斷裂面細節。金屬/碳複合鍍膜能夠實現樣本在SEM（塊面）或TEM（復型）中的成像，主要用於研究如細胞器、細胞膜，細胞層和乳膠。這項技術傳統上用於生物學應用，但現在逐漸在物理學和材料科學中展現出重要意義。近年來，研究人員透過冷凍斷裂電子顯微鏡，尤其是冷凍復型免疫標記（FRIL），對膜蛋白在動態細胞過程中所發揮的作用有了新的見解。作者：Gisela Höflinger

圖1：麥葉上的蚜蟲

適合於電子顯微鏡的環境電子顯微鏡的樣品室透過抽真空處理降至極低壓力。置於這種環境下的活細胞無法有效保全結構，因為細胞構成中的大部分水分會快速蒸發。生物樣本的製備方法有很多種。樣品材料被（固定）儲存，這樣後續脫水對原位結構的破壞最小，同時可以使用環境掃描電鏡（SEM）或者將水冷凍。高壓冷凍是觀察自然狀態下含水結構的唯一方法。高壓冷凍所形成的冰不是六邊形冰（從水變為六邊形冰時體積會增加）而是無定形冰，因此體積保持不變。所以，對滲透和溫度變化敏感的結構得以保留（見文章“高壓冷凍基礎介紹”）。要觀察諸如細胞器、細胞膜、乳膠或液體的表面介面等結構，冷凍斷裂是唯一的方法。透過刀片（或類似物）或釋放彈簧負載的外力來破開冷凍樣本，並沿著最小阻力線斷裂樣本。

圖2：冷凍斷裂（來源：http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Lipids/Membrane_Fluidity）

水的昇華與凝結 – 冷凍蝕刻與汙染要暴露冷凍斷裂面，需要把冰去除。這就需要透過把斷裂面的冰昇華去除以儲存樣品的結構。昇華的過程是冰不經過液態過程直接轉化為氣態。而液態過程會導致樣品體積和結構的破壞。

圖3：ES，細胞外表面；PF，細胞膜冷凍斷裂面；EF，細胞膜外層冷凍斷裂面；FS，細胞膜內表面；Cyt，細胞質

水的昇華/冷凝過程取決於特定溫度下的飽和壓力，以及水或冰在室內的有效水分壓。注意：良好的真空度會降低水分壓。例如：溫度為-120℃的冰或冰凍樣本飽和壓力約為10-7 mbar。如果樣品室內達到這個壓力，則冷凝和蒸發處於平衡狀態。蒸發的分子數量等於冷凝的分子數量。在更高壓力下，冷凝速度要快於昇華速度 – 因此冰晶會在樣本表面上生長。必須採取一切手段來避免這種情況。樣本上方一個較冷（比樣本更冷）的冷阱會降低區域性壓力，從而起到了冷凝阱的作用。從樣本中帶出的水分子優先附著在較冷的表面上。在低於飽和壓力的壓力下，更多的分子昇華而不是冷凝，同時會發生冷凍蝕刻。執行冷凍蝕刻直到樣本完全無冰，這一過程稱為冷凍乾燥。僅適用於合理時間內執行的小樣本。該過程分為幾個步驟，需要從大約-120℃加熱到-60℃，同時在每個步驟上使溫度保持一定時間。該過程需要幾天的時間來完成。

圖4：飽和蒸汽壓力（感謝Umrath 1982提供的圖片）

樣本溫度低於-120℃時，蝕刻速度非常慢，蝕刻持續時間會增加到不切實際的程度。如果真空室的壓力固定，則可以透過提高樣本溫度來提高蝕刻速度。對於生物樣本，要特別小心溫度高於-90℃。蝕刻速度會大幅提高。另外，要注意玻璃態冰中形成六邊形冰晶從而導致脫水偽像。

純水的理論昇華速度會降低，因為：

樣本深處的水昇華速度比表面的水更慢。鹽和大分子溶劑會降低昇華速度。生物樣本中大量存在的結合水會降低昇華速度。

透過冷凍斷裂生成影象

冷凍斷裂和冷凍蝕刻技術往往採用高真空精細鍍膜技術，將超細膩重金屬和碳薄膜沉積於斷裂表面。

冷凍斷裂樣本在一定角度下用金屬覆蓋，然後在碳背襯膜（徠卡EM ACE600冷凍斷裂或徠卡EM ACE900與徠卡EM VCT500）上生成復型進行TEM成像或在SEM的試塊面上進行成像。

對於這兩種方法，冷凍斷裂表面經過一定的蝕刻時間後以相同的方式進行鍍膜。首先在一定角度下進行一層薄的（2-7nm）重金屬鍍膜，以形成地形對比度（陰影）。其次再針對重金屬薄膜，在90°下進行一層厚的碳層（15-20nm）鍍膜，以穩定超薄電子束蒸發。此時的蝕刻處理會停止。要對極小的結構進行成像，需要在極低的角度（2–8°）鍍膜重金屬並在鍍膜期間旋轉樣本。這樣可增加細絲狀及其它細小結構的對比度。此項技術又稱為小角度旋轉投影。

蒸鍍重金屬薄膜需要採用電子束蒸發鍍膜技術。這種鍍膜技術可實現精細定向沉積。碳的支撐層穩定了未被金屬覆蓋的結構。隨著溫度的升高，這些結構會改變它們的輪廓，樣本不會完全導電，復型也不會粘在一起。

冷凍斷裂酵母的單向投影

圖5：低溫SEM，BSE（背散射電子）影象。

圖6：復型，TEM影象

圖7：徠卡高壓冷凍真空冷凍傳輸至冷凍斷裂系統中利用電子束髮射槍和旋轉樣本底座來進行冷凍蝕刻和低溫鍍膜

圖8：徠卡高壓冷凍利用電子束髮射槍和旋轉樣本底座來進行冷凍蝕刻和低溫鍍膜。徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM。

圖9：徠卡冷凍斷裂系統及徠卡真空冷凍傳輸至低溫SEM的HPF、冷凍斷裂、冷凍蝕刻和低溫鍍膜。

圖10：TEM中的酵母細胞復型。

圖11：大麥葉上的真菌。安裝於徠卡冷凍斷裂儀樣本臺上，並透過冷卻樣本臺在液氮下進行冷凍。

相關產品

徠卡EM ACE900高階EM樣本製備冷凍斷裂系統

徠卡EM VCT500