2021年2月19日，哈佛大學和Broad研究所的劉如謙 (David R. Liu) 團隊與哈佛大學醫學院和波士頓兒童醫院的董民團隊合作在Science線上發表了題為Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity 的文章，報道了他們利用噬菌體輔助的持續演化系統對肉毒素的蛋白酶做了定向進化，首次實現了徹底改變毒素蛋白酶底物特異性，創造出新的毒素突變體可以在神經細胞裡特異性切割對神經再生起阻礙作用的重要藥物靶點蛋白（磷酸酯酶與張力蛋白同源物，PTEN）。該項工作也首次建立了一套完整的蛋白酶定向進化方法， 具有重大的科學和應用價值。
特異性的蛋白酶在細胞和人體機能中起到重要的調控作用。目前基於蛋白酶的藥物開發和應用侷限於每種蛋白酶天然的特異性。對蛋白酶的改造工作在過去往往只限於擴充套件可以切割的底物範圍，而不能同時消除其對天然底物的活性。哈佛大學和Broad研究所的劉如謙團隊多年來一直在探索用他們實驗室開發的噬菌體輔助的持續演化系統（PACE）來定向進化蛋白酶。為突破對天然底物的活性限制，劉如謙團隊改進了持續演化系統，不僅可以透過正向篩選使蛋白酶識別一個全新的底物，也設計了反向篩選來去除原本的底物特異性，從而可以創造出人造的全新的特異蛋白酶 (圖1)。哈佛大學醫學院和波士頓兒童醫院的董民團隊多年從事肉毒素領域的研究。兩團隊合作選擇了有廣泛應用的肉毒素蛋白酶作為實驗物件，在三種不同的肉毒素蛋白酶上開展了一系列的定向演化工作。
肉毒素是一類由革蘭氏陽性菌肉毒桿菌（Clostridium Botulinum）所產生的蛋白質毒素。它十分特異地靶向神經細胞，是自然界中已知的毒性最高的毒素。近30年來，肉毒素已經被廣泛用於治療慢性偏頭痛、頸部肌張力障礙、尿失禁、瞼痙攣和醫學美容除皺。該毒素家族目前已知有七種亞型（BoNT/A到BoNT/G）。所有的肉毒素都由一條重鏈和一條輕鏈構成。重鏈主要負責靶向神經細胞和遞送輕鏈到細胞內部。輕鏈是一個金屬蛋白酶，負責特異性切割神經元內負責囊泡與細胞膜融合的相關蛋白（SNARE蛋白），從而阻止神經遞質從囊泡中釋放。每一種亞型的肉毒素都會特異地切割一種或幾種SNARE蛋白，例如肉毒素A、C和E切割SNAP-25，肉毒素B、D、F和G切割VAMP1、2、3，肉毒素C還可以切割Syntaxin1。近期董民團隊也發現了新型的肉毒素X。這種毒素可以切割6種SNARE蛋白，VAMP1、2、3、4、5和Ykt6，迄今為止自然界中可以切割最多種SNARE蛋白的肉毒素(Zhang et al., 2017)。
劉如謙團隊發明的PACE系統的主體是一個生物反應器，稱為Lagoon，其中有M13噬菌體和大腸桿菌作為噬菌體的宿主。M13噬菌體基因組中的gIII基因被需要進化的蛋白酶基因所取代，而gIII基因所編碼的蛋白pIII是噬菌體能否被正確包裝和具有感染力的關鍵蛋白。當M13噬菌體感染大腸桿菌後，它的單鏈閉環DNA基因組會被轉入大腸桿菌並轉化為雙鏈閉環DNA，稱為選擇質粒（SP）。大腸桿菌自身還有輔助質粒（AP）和突變質粒（MP）。輔助質粒編碼一個活性被T7 溶解酶抑制的T7 RNA聚合酶和一個T7 啟動子控制的gIII。T7 RNA聚合酶和T7溶解酶之間由一段蛋白酶可以識別並切割的底物多肽連線。當選擇質粒編碼的蛋白酶可以切割T7 RNA聚合酶和T7溶解酶之間的連線時，T7 RNA 聚合酶的活性得以釋放，從而開始轉錄gIII，得到有侵染活性的噬菌體。反之則無法得到具有侵染活性的噬菌體。突變質粒則表達一些提高DNA複製時突變機率的蛋白，在噬菌體DNA複製時引入突變到蛋白酶的基因中。由於這個反應器不斷地有新鮮的培養基和大腸桿菌宿主流入，並且有舊的培養基和大腸桿菌流出，只有當一個噬菌體編碼的蛋白酶可以啟用T7 RNA 聚合酶產生新的更多的具有感染力的噬菌體的時候，這個噬菌體才能透過不斷地感染新的大腸桿菌並複製而留在這個反應器之中。由於噬菌體的生命迴圈時間很短約10分鐘，所以每天可以進行大數量的篩選並且整個過程不需要很多的人工干預，極大地提高了分子進化速度。
為了可以降低進化的蛋白酶對原始識別序列的活性。劉如謙實驗室在原先正向選擇的系統上，在大腸桿菌宿主裡添加了一個反向選擇質粒 (Morrison et al., 2020)。反向選擇質粒編碼一個由蛋白酶原始的識別序列多肽連線的T3‘ RNA 聚合酶和T7 溶菌酶，和一個由T3 啟動子控制的顯性失活gIII。當噬菌體所編碼的蛋白酶既可以啟用正向選擇質粒gIII的表達和反向選擇質粒的顯性失活gIII表達時，產生的新的噬菌體不具備感染性。也就是說，只有進化活性而沒有原始活性的蛋白酶將會擁有選擇優勢而被篩選出來。當正向選擇和反向選擇同時進行時，他們之間的最佳相對選擇強度一般很難預測，往往需要同時做幾種選擇強度的路線去尋找一個較好的條件。由噬菌體輔助的持續演化系統（PACE）簡化而來的噬菌體輔助的非持續演化系統（PANCE）有利於實驗者同時進行多條不同條件的進化，常被用於同時進行正向和反向選擇。
圖1：PACE模式圖
首先，作者選擇野生型的肉毒素X的輕鏈作為目標，利用PANCE系統將肉毒素X的偏好性向VAMP4和Ykt6進化。經過進化得到的突變體X(4130)B1和X(5010)B1分別對Ykt6和VAMP4的偏好性相對於VAMP1有了大幅提升。這兩個肉毒素X輕鏈突變體也可以在全毒素的形式下被遞送到體外培養的大鼠的神經元裡切割其底物。
將一個肉毒素的輕鏈進化為可以識別並切割新的SNARE蛋白底物是一個更具挑戰的任務。VAMP7是一種非經典SNARE蛋白，在蛋白的轉運，分泌和細胞自噬中發揮重要作用。已知肉毒素都不能切割VAMP7。作者利用PACE的正向篩選逐漸將肉毒素F輕鏈進化為對VAMP7具有切割活性，得到突變體F(3041)B6。雖然F(3041)B6可以切割VAMP7，但是它還對保留有VAMP2的切割活性。又經過一系列的反向篩選，作者得到了另一個突變體F(3230)A3。這個突變體在體外酶活實驗中展示了很高的VAMP7和極低的VAMP2切割活性 (圖2)。
圖2：肉毒素F的突變體F(3230)A3的體外酶動力學曲線
第三個，也是本文中意義最為重大和最難的工作是將肉毒素E輕鏈從切割SNAP-25進化為特異性地切割磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）。PTEN是一個磷酸酶，將PI3P轉化為PI2P，負性調控細胞膜上的PI3P水平，從而抑制PI3K/AKT/mTOR訊號通路並抑制細胞增殖。突變導致PTEN功能缺陷是一些細胞癌變的重要原因，因此PTEN也被認為是一種抑癌蛋白。不過在神經元再生方面，PTEN卻起到了抑制再生的作用。在受損的中樞神經元中敲除PTEN已經被證明可以極大地提高神經元的再生能力。
作者透過生物資訊學比對選擇了PTEN表面一段沒有固定構像的肽段作為潛在的酶切靶點。這一段序列的20個氨基酸中僅有4個與SNAP-25 序列相同。經過一系列的正向和反向篩選作者最終得到了一個突變體E(4130)A2。在體外酶活實驗中，E(4130)A2對PTEN有較高的切割活性，而對SNAP-25的活性極低。但是當將E(4130)A2和PTEN共同表達在HEK293T細胞中時，並沒有觀察到明顯的PTEN切割。作者分析也許由於PTEN在細胞膜上行使功能，而E(4130)A2主要在細胞質中，所以切割效率不如預期。當作者將定位在細胞膜上的PH結構域和E(4130)A2融合表達時，全長PTEN的水平顯著下降。作者還透過病毒轉染的方式在體外培養的大鼠皮質神經元中表達了PH-E(4130)A2，發現相對於對照組神經元中的PTEN水平有明顯的下降，並且在神經細胞內部只有極低的SNAP-25切割活性。在E(4130)A2的基礎上，作者根據肉毒素E識別SNAP-25蛋白結構方面的知識又加入了一個突變L167A，完全消除了對SNAP-25的切割活性。
圖3：肉毒素E的突變體E(4130)A2對大鼠皮質神經元PTEN的降解
綜上所述，本研究利用PACE平臺實現了對肉毒素的活性實現了重新設計，不僅可以使其識別一個全新的底物，還可以透過反向篩選幾乎完全去除了原本的活性和神經毒性。令人驚歎的是在PTEN和SNAP-25序列同源性極低的情況下也實現了進化，創造出了一個全新的蛋白酶。具有PTEN切割活性的PH-E(4130)A2有巨大的潛力用於促進神經損傷後的再生。該技術也可以廣泛應用於未來的蛋白酶和蛋白藥物工程改造。
哈佛大學和Broad研究所的Travis Blum 博士為本文第一作者， 研究團隊成員包括劉如謙實驗室Michael Packer 博士和Michelle Richter， 和董民實驗室劉浩博士，熊小哲博士，Pyung-Gang Lee 博士，和張四才博士。
原文連結：
https://science.sciencemag.org/content/371/6531/803
製版人：十一
參考文獻
1. M. Dong, G. Masuyer, P. Stenmark, Botulinum and Tetanus Neurotoxins. Annu Rev Biochem 88, 811-837 (2019).
2. M. Morrison, M. S., Podracky, C. J., & Liu, D. R. The developing toolkit of continuous directed evolution. Nature Chemical Biology, 16(6), 610–619. (2020)
3. S. Zhang et al., Identification and characterization of a novel botulinum neurotoxin. Nature Communications, 8:14130 (2017)
4. K. Liu et al., PTEN deletion enhances the regenerative ability of adult corticospinal neurons. Nat Neurosci 13, 1075-1081 (2010).