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假如PCR實驗室的實驗結果總是出現假陽性的現象,明明沒有加模板,最後卻擴出了產物。那就要注意一下操作環境。這裡涉及氣溶膠的概念,氣溶膠是由固體或液體小質點分散並懸浮在氣體介質中形成的膠體分散體系,能在空氣中滯留至少幾個小時。

  PCR反應過程中不斷進行升溫降溫,液體蒸發又冷凝,PCR管中部分空氣形成氣溶膠,攜帶大量的DNA擴增產物(注意,1ng擴增產物中可作為模板的DNA片段數量,超過1ng起始模板中可擴增DNA片段數量的幾百萬倍甚至更高。比如人的基因組DNA有30億個bp,要擴增的單複製基因片段是300bp,1ng起始模板中可以作為模板DNA片段只佔總起始模板DNA總量的千萬分之一)。如果在實驗室開啟含PCR擴增產物的管蓋,大量攜帶DNA擴增產物的氣溶膠就會湧出,擴散到空氣中,從而對環境造成汙染。

  雖然在整個空間環境中DNA的含量很低,但由於理論上只要有1個可作為模板的DNA片段也能PCR擴增成功,這就是為什麼在汙染環境中陰性對照也能擴增出條帶的原因。所以在專業的PCR實驗室(比如臨床PCR檢驗實驗室),通常有四區隔離(或至少是三區隔離)的要求。 常見的三區是指:

  1、試劑配製區:PCR反應體系的配製區域。

  2、標本處理區:包括擴增模板的製備,即提取DNA的地方。

  3、PCR擴增和產物分析區:進行PCR擴增的區域,也是擴增產物進行凝膠電泳分析的區域。

  如果將PCR擴增區域和產物分析區再次分開,就是四區隔離。四區隔離,主要目的是防止氣溶膠在各個PCR區域之間的流動,最好的方法是每個區域隔一幢樓,但操作起來不現實,於是便有了針對不同區域設定正負壓的方法:

  試劑配製區(Ⅰ區):最潔淨的區域,保持微正壓使得外界空氣無法進入隔離汙染源。並且陰性模板應該在此區加入PCR管並蓋蓋,嚴禁在此區域開啟、存放裝有DNA模板的離心管。

  DNA模板新增區(Ⅱ區):壓力比Ⅰ區低,保證內部空氣不外洩,以免陽性模板的氣溶膠對外界環境造成汙染。

  擴增及PCR產物分析區(Ⅲ區):保持負壓,使得內部空氣不外洩,以免擴增產物的氣溶膠對外界環境造成汙染。

  操作時壓力遵循Ⅰ區→Ⅱ區→Ⅲ區單一方向進行,不可逆向進行。

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