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作者按

發育，衰老，再生。三個不同的生物學主題，但彼此的分子機理又遙相呼應。

在下面的故事中，具有發育生物學背景的王偉博士在尋找本領域博後遇挫後，嘗試利用一種新型的魚類衰老模型研究再生與發育在基因表達的差異再遭失敗，最終卻意外地找到了一系列全新的對再生過程特異性響應的基因調控序列——再生響應增強子；痴迷於揭示衰老機制的呂垣澄在博士研究的前四年屢戰屢敗，卻意外地發現一組對逆轉衰老寄予厚望的轉錄因子竟能啟用神經元的再生。

在未來，我們能否真正理解衰老在基因表達上的本質特徵？又能否找到安全有效的手段，真正做到逆轉衰老？

誰道人生無再少？門前流水尚能西！休將白髮唱黃雞。

撰文｜黃宇翔

責編｜陳曉雪

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第一節 另謀出路

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和幾位心儀的教授談完，王偉的心已經涼了半截。

王偉在博士期間研究影響果蠅體節發育性別差異的分子機制 [1,2]，對果蠅發育原理產生了濃厚的興趣，因此藉著這次參加果蠅發育大會的機會，打算向領域內幾位研究果蠅發育進化機制的學術大牛毛遂自薦，主動尋求博後研究的工作崗位。

但一番談話下來，王偉發現幾位領域內的領軍人物紛紛看衰果蠅發育進化領域未來的發展前景，認為目前基本的框架已經建立，不太會有特別重要的新發現了。

大牛們自己紛紛計劃另謀出路，去尋覓新的研究領域，因此都不太可能在他們眼中已經“過氣”的方向上繼續招人。

第二天，王偉為自己的研究設定了一個新的方向：再生。

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發育與再生，二者之間有著千絲萬縷的聯絡。

生命體在發育過程中，一系列基因的選擇表達決定了組織器官的形成，並在發育過程結束後及時關閉，處於休眠狀態。那麼，當組織器官發生損傷時，特定的刺激是否能夠重新喚醒沉睡已久的基因再次表達，在受傷的器官上讓發育的部分過程再次上演，進而實現對器官的修復？

檢索近年來活躍在再生領域的研究團隊，Sánchez Alvarado 這個重複出現的名字喚醒了王偉腦中一段久遠的記憶：Sánchez Alvarado 曾在幾年前某次發育生物學大會作過主題報告，介紹其利用渦蟲研究器官再生原理的發現。更巧的是，王偉發現自己已經報名在6月的一門由海洋生物學實驗實驗室（MBL）舉辦的胚胎學培訓課程，主管負責人正是美國斯托瓦爾斯研究所（Stowers Institute）對 Sánchez Alvarado 教授。

面試非常順利，Sánchez Alvarado非常希望王偉能加入自己的團隊，但同時坦誠地告訴他目前實驗室的渦蟲小組人員已經接近飽和：“偉，你有沒有興趣去開拓一個新的模式動物的再生原理——非洲青鱂魚？”

非洲青鱂魚（African turquoise killifish）是一種生存於非洲乾旱地區的野生小魚，平均壽命只有四到六個月。斯坦福大學的Anne Brunet實驗室飼養了一些在實驗室，用於衰老的研究。

而Sánchez Alvarado之所以會對這種短命小魚產生興趣，則是源於再生領域內長期的一個不足：研究者使用各式各樣的實驗體系研究再生的分子機理，但彼此之間的結論卻因為物種之間的巨大差異而難以整合在一起。

“脊椎動物中研究者最常用的模式動物是斑馬魚和小鼠，但考慮到斑馬魚和小鼠之間的差異，從一種實驗動物中得出的結論很難在另一種生物中進行比較。” Sánchez Alvarado向王偉解釋起再生領域內部研究者之間通力合作的一大阻礙，“但如果我們能直接比較斑馬魚和非洲青鰹魚，那就很可能得到一些非常有意思的新發現了。”

生物學研究的本質是對照，而再生研究者最缺乏的恰恰就是一個合適的對照動物模型。

在再生研究領域建立一個新的魚類模型，這對於領域會是個重大的推動，並且自己在研究生階段確實也積累了不少建立新模型的經驗。因此在思考了兩週之後，王偉正式決定加入Sánchez Alvarado的團隊。

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當時在全美範圍內，能夠在實驗室中飼養繁殖非洲青鱂魚的，僅有斯坦福大學Anne Brunet一家。

因此在到達堪薩斯後的第一個月，王偉就和實驗室管理員飛到灣區向Anne Brunet實驗室的成員學習養魚技術，並要到了80個魚卵帶回斯托瓦爾斯研究所。

申請飼養一種新的實驗動物，需要到動物中心辦理許多手續，因此在非洲青鱂魚的專屬魚房建成之前，王偉需要為這80個魚卵找一個孵化場所。於是Sánchez Alvarado騰出了自己的一間辦公室，專門供王偉在其中養魚。

有了地方，魚卵的孵化卻出了大問題：儘管孵化條件處處都照搬Anne Brunet實驗室傳授的要訣，但魚卵卻紛紛孵化失敗。80個魚卵到頭來只孵出了10只病怏怏的小魚。

王偉一面祈禱這十隻 “希望之魚” 能儘快交配繁殖，一面想方設法調節魚箱的條件讓非洲青鱂們茁壯生長。

Anne Brunet實驗室的養魚之路也剛剛起步，魚的狀態也常常起伏，能分享的經驗十分有限，因此王偉能依靠的只有自己。

在實驗室中模擬出一種讓野生生物興旺生長的環境究竟有多艱辛，王偉的體會隨著不斷的失敗日益加深。在接下來整整兩年的時間裡，他絕大多數時間都花在了每天給二三十缸魚換水、摸索它們孵化、發育、繁殖的實驗條件上。

終於在2015年底，他熟諳了非洲青鱂魚的生長特性，已經能夠穩定地培養出健康的魚兒了。

其中的關鍵細節有兩個。

第一是水溫。王偉從Anne Brunet實驗室學到最適宜非洲青鱂魚生長的水溫在26度左右，但培養了一段時間后王偉發現非洲青鱂魚胚胎在這個水溫下常常自動進入休眠，使得胚胎髮育不同步、孵化率很低——如果把水溫略微上調到28度，僅僅兩度的細微差別，就能大大提升非洲青鱂魚胚胎同步發育及孵化成功率。

其次是氧氣濃度。為使魚苗孵化後能將魚鰾正常充氣，Anne Brunet實驗室會向孵化容器中額外新增一種在溶解後會釋放氧氣的“藥片” 。但王偉發現，加了溶氧藥片反而會讓青鱂魚苗長得更差——原來溶氧藥片產生的過多氧氣對於青鱂魚苗而言毒性很大，而且透過藥片釋放氧氣的速率很難得到精確的控制。後來，王偉給魚缸安裝了通氣的迴圈系統，終於找到了一個為魚群提供穩定氧氣供給的方法。

終於建立好了養魚系統，王偉迫不及待地開始了第一批的再生實驗。

他和導師的預期是非洲青鱂魚的再生能力會比較弱，因此如果從魚鰭上切下一小段，不太會引發像斑馬魚那樣強力的自我修復現象。

Anne Brunet實驗室做的初步實驗也表明，對於非洲青鱂魚來說，斷“鰭”確實難再續。

但在王偉從第一批成年的非洲青鱂魚身上割下一截魚鰭一週之後，新的魚鰭竟然奇蹟般地長了出來！

這是怎麼回事呢？

短命的非洲青鱂魚（圖片來自王偉博士）

第二節 刮目相看

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在實驗室渦蟲組的同事們都不太看好的情況下，王偉耗時兩年，終於在實驗室建成了非洲青鱂魚的養殖系統。

出乎王偉和Sánchez Alvarado的意料，非洲青鱂魚在被割去部分魚鰭之後，只需要一週，竟然就能重新生長出全新的魚鰭。

幾次重複之後，王偉不僅確認了這一事實，並且找到了自己與Anne Brunet實驗室不同實驗結果的原因：Anne Brunet實驗室的再生實驗是切割年老青鱂魚的尾鰭，不能觀察到尾鰭再生；王偉切割的是年輕青鱂魚的尾鰭，能引發尾鰭再生。這說明非洲青鱂魚尾鰭的再生能力會隨年齡增大而衰退。

實驗現象與預期背道而馳，王偉立刻調整了思路，將自己的科學問題修改為：“在尾鰭再生的過程中，非洲青鱂魚與斑馬魚中存在哪些共同的修復因子？”

時間很快來到了2016年的4月，王偉經過了一年多的篩選，還沒有發現任何一個有希望的基因。王偉後來猜測認為，這輪篩選失敗的原因可能是絕大多數的已知再生修復因子對於正常發育同樣重要，因此在將它們敲除之後導致非洲青鱂魚根本無法活到成年做尾鰭切割手術。

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就在篩選陷入停滯的時候，一篇新發表在《自然》的論文，為王偉帶來了新的啟發。

杜克大學Kenneth Poss團隊發現，斑馬魚的尾鰭和心臟在發生再生時，一些被稱作 “增強子” 的調控序列的活躍程度會顯著升高。“增強子”是分佈在基因組中的一些DNA片段，自身不會表達出有功能的蛋白質，但能透過啟用其他基因的轉錄效率實現對基因表達的調控功能。

這一發現首次證明斑馬魚體記憶體在一些增強子，可以在再生修復過程中被啟用，但所鑑定出的增強子在敲除後並不會顯著破壞斑馬魚的器官再生能力 [3,4]。這意味著，再生修復的調節很複雜，只破壞其中一部分增強子，還有其他未知的調控元件維持斑馬魚必要的再生啟用。

也許基因的選擇性表達才是魚類器官再生的關鍵？王偉忽然覺得自己此前專注於尋找再生特異基因的想法可能走錯了方向。

在同事曾安和胡德慶的幫助下，王偉將實驗方法改為用ChIP-seq技術去搜索斑馬魚和非洲青鱂在損傷刺激下活躍性增加的增強子片段。

到了2017年年底，王偉找到了在兩種魚類中進化保守的49個增強子片段——這些增強子的活性在魚鰭再生的過程中處於高度活躍的狀態。進一步的表達實驗表明，這些增強子區域的確會在再生的過程中被啟用。另外，王偉利用生物資訊學分析找出了人源的IEN（inhba enhancer），將人源的IEN放在魚中表達，也會對受傷的情況響應，也就是說王偉在功能上證明了人源IEN具有再生響應能力。

更為有趣的是，透過對篩選出的增強子序列進行分析，王偉發現上游啟用這些增強子的很可能是同一個轉錄因子——AP-1，這是一個在各類細胞中都廣泛存在的轉錄因子。

那麼問題來了，這些增強子片段在功能上對於尾鰭的再生究竟是否必不可少呢？

敲除IEN片段，非洲青鱂魚的尾鰭、心臟再生能力顯著受損；在此基礎上表達魚源IEN能重新恢復非洲青鱂的再生能力，但是表達人源的IEN卻不能恢復非洲青鱂的再生能力，說明人源的IEN在進化過程中發生了功能性變化。

這是歷史上第一次找到具有功能的再生響應增強子！

更有趣的是，在比較兩種生活環境差異很大的魚類之後，王偉發現對再生必須的再生響應增強子是可進化的，並且鑑定出了保守的基因和調控元件，同時提出解釋脊椎動物再生能力不均勻的理論模型。

2020年9月4日，這一發現發表於《科學》雜誌 [5]。

2021年，王偉博士在北京生命科學研究所建立獨立的實驗室，進一步利用非洲青鱂這一模式生物深入探索再生在分子水平的秘密。

王偉博士，現北京生命科學研究所研究員

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相對於魚類強力的器官再生能力，哺乳動物確實難以望其項背。

但器官再生的秘密，在演化的過程中是否被隱匿於關閉表達的基因網路之中？

調節基因的表達，是否能重新喚起哺乳動物體內沉睡已久的再生開關？

就在王偉準備將自己從青鱂魚中獲得的啟示投稿出去的同時，在遠隔千里的波士頓，一名研究生正為眼前顯微鏡畫面中小鼠視網膜神經節細胞所呈現出的驚人畫面興奮不已。

第三節休將白髮唱黃雞

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2018年6月28日，哈佛醫學院共聚焦顯微鏡中心。

博士四年級的呂垣澄在低倍鏡下找到了視網膜神經節細胞散發的模糊光斑，忐忑地將鏡頭切換到高倍鏡。

當顯微鏡重新對準焦距之後，在顯微鏡連線的電腦螢幕上，一縷縷纖細的線條從軸突斷裂的位點蔓延湧出，然後慢慢消失在前方的黑暗之中。

“本，你覺得這些訊號是來自真正再生出的軸突嗎？”呂垣澄激動地等待著身旁夥伴的反應。

“沒錯，軸突真的是重新長出來了。” Benedikt（Ben）Brommer憑藉自己觀察視神經節細胞軸突的豐富經驗給出了肯定的答覆。

呂垣澄立刻意識到，自己作出了一個真正的突破性發現。

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如果將時針回撥到半年以前，呂垣澄在 “逆轉衰老” 課題上的摸索仍然顯得遙遙無期。

他的導師是衰老領域的學術明星 David Sinclair，實驗室的研究興趣緊緊聚焦在 “衰老” 的話題上。

在研究生的前四年時間，他嘗試了表達轉錄因子Nanog、化學小分子誘導等多種方式改變衰老小鼠細胞的表觀遺傳狀態，但或是效果太差、或是毒性太強，都以失敗告終。

因獲諾獎而聞名的山中伸彌因子（Yamanaka factors），承載著他最後的一絲希望：2016年，Salk研究所的Juan Carlos Belmonte團隊將Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc這四種能誘導細胞進入幹細胞狀態的轉錄因子同時表達在早衰模型的小鼠體細胞後，大幅延長了早衰小鼠的壽命 [6]。但上述這項研究也存在著明顯的侷限性：同時表達四種山中伸彌因子顯著提高了小鼠罹患畸胎瘤的風險，另外該研究使用的都是轉基因小鼠，因此無法向臨床疾病拓展。

呂垣澄決定背水一戰，在四種山中伸彌因子中剔除一個致癌基因c-Myc，將剩餘的三種轉錄因子（ot4、Sox2、Klf4簡稱為OSK）整合進一個AAV（腺相關病毒）載體注入小鼠體內。

然而，儘管呂垣澄注射的AAV載體理論上應該能侵染到小鼠全身各類細胞，但他很快發現重組的OSK實際僅僅主要在肝臟細胞中表達。

而肝臟，在哺乳動物各個組織器官中恰恰又是衰老速度最為緩慢的。

研究的前路看上去被堵得死死的。

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呂垣澄重新理了理思路，究竟什麼器官最先表現出衰老的症狀？

器官衰老的普遍表現之一，就是其再生能力的下降。長期以來的研究表明，中樞神經系統的再生能力是最早喪失的，出生幾天後神經系統的軸突就無法再生了。因此，中樞神經系統的損傷是最難以修復的，比如車禍或者中風導致的癱瘓，以及帕金森，阿爾茲海默等神經退行性疾病導致的行動能力下降，亦或是衰老或疾病導致的視力衰退。

而幫助呂垣澄製備表達OSK的AAV的何志剛教授實驗室，恰巧專注研究能促進神經細胞在受到損傷後軸突再生的分子機制。

眼睛是中樞神經的延伸，不如直接試試把AAV打進眼睛裡，看看錶達OSK能不能促進視網膜神經元的軸突再生！呂垣澄把這個大膽的想法寫進了一份哈佛醫學院內部的基金申請，抱著試一試的態度交了上去。

很快，基金申請得到批准的好訊息傳來。經費到位，呂垣澄立刻與何志剛實驗室展開了合作——何志剛實驗室的資深技術員王晨幫助呂垣澄注射AAV和建立視神經損傷模型，博後Ben Brommer指導呂垣澄使用共聚焦顯微鏡測量視神經軸突的再生情況。

6月28日，到了觀察結果的這一天，坐在冷凍切片機前的呂垣澄異常緊張，如果這個實驗再不成功，前路又將陷入迷茫，博士畢業也將遙遙無期。

他深吸了幾口氣才讓自己平靜下來，然後屏住呼吸小心翼翼地進行切片。因為小鼠的視神經非常細，每一片切片的厚度只能有14µm，比我們最細的頭髮絲還要細。

隨後，他和技術員餘豆豆（處於本科畢業後的gap year ，目前已經申請到博士專案）與Ben一起將第一次收集到的誘導表達OSK後切斷軸突的視神經切片拿到顯微鏡下觀察。

坐在冷凍切片機前的呂垣澄舉著第一個OSK誘導視神經再生的切片。本圖由呂垣澄提供。

昏暗狹窄的顯微鏡室內，看到再生的視神經的瞬間，呂垣澄難以抑制住自己內心激動的心情，興奮地叫出聲來，與餘豆豆和Ben擊掌相慶。

接下來，呂垣澄的這一研究獲得了一個個的新進展：

在視神經軸突被夾斷後再表達OSK，仍然能誘導軸突的再生，顯示出治療（而不僅是預防）的前景——如果驗證其能用於脊髓神經再生，對癱瘓的病人將是極好的訊息；

在年老的小鼠中表達OSK，損傷後的軸突也能在被夾斷後長出 “新枝”，表明其效果不受年齡的限制；

與麻省總醫院專攻眼科疾病的 Meredith Ksander、Bruce Ksander 夫婦的合作，發現OSK表達能部分恢復青光眼疾病模型小鼠甚至是年老小鼠的視力，表明OSK表達不僅能恢復 “形態”，在功能水平同樣對受損的視神經也有增益效果；

在安全性上，最早一批表達OSK的小鼠在生存兩年之後並沒有表現出比對照組更高的患癌風險。

更有趣的是，當他們去測量小鼠視神經細胞的表觀遺傳修飾，驚訝地發現軸突損傷會迅速增加視神經元的“表觀遺傳年齡”，而表達OSK能使 “表觀遺傳年齡” 的青春常在，恢復年輕的表觀遺傳修飾和基因轉錄水平——其中，DNA去甲基化酶TET1/2的作用必不可少，表明DNA的甲基化修飾是參與衰老和再生相關基因表達調控的一大重要修飾。

另外，實驗室的同事田驍幫助呂垣澄對人類神經細胞進行了體外測試，發現OSK重程式設計同樣能夠誘導人類神經細胞軸突在損傷後的再生。

2019年7月31日，趕在妻子生產的前一天，呂垣澄將這些發現的相關資料和內容整理好，投稿《自然》並上傳到預印本網站bioRxiv。之後經過一年多兩輪的審稿和補充實驗，這些發現最終在2020年12月3日作為封面文章發表於《自然》雜誌 [7]。

哈佛大學已經將這一創新技術授權給波士頓的 Life Biosciences，期待將其用於人類衰老相關疾病，如青光眼病等的治療。

呂垣澄也將再接再厲，與多個實驗室合作，嘗試在更多的器官中測試OSK療法促進再生和逆轉衰老的效果，並加入麻省理工的Jonathan Weissman 實驗室做博後，探索表觀遺傳重程式設計的機理和更多途徑。

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發育，衰老，再生。

三個不同的主題，但彼此的分子機理卻又遙相呼應。

王偉的研究啟發我們思考：當損傷發生時，機體是否能透過調動原本只在發育過程中啟用的基因表達，讓組織器官在 “二次發育” 的過程中實現再生？呂垣澄則透過他的OSK實驗向我們揭示：再生能力之所以會隨著機體的衰老而降低，本質上有可能是衰老引發了DNA甲基化修飾增加，阻礙了再生調控元件對細胞命運的重程式設計。

在未來，我們能否真正理解衰老在基因表達上的本質特徵？又能否找到安全有效的手段，真正做到逆轉衰老？

誰道人生無再少？門前流水尚能西！休將白髮唱黃雞。

2018年6月28日，呂垣澄在顯微鏡下觀察的影象：相比對照組，OSK表達視神經細胞損傷後長出許多新的軸突 [7]。

參考資料：

[1]Wang, W., Kidd, B. J., Carroll, S. B. & Yoder, J. H. Sexually dimorphic regulation of the Wingless morphogen controls sex-specific segment number in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences 108, 11139-11144 (2011).

[2]Wang, W. & Yoder, J. H. Hox‐mediated regulation of doublesex sculpts sex‐specific abdomen morphology in Drosophila. Developmental dynamics 241, 1076-1090 (2012).

[3]Kang, J. et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature 532, 201-206 (2016).

[4]Thompson, J. D. et al. Identification and requirements of enhancers that direct gene expression during zebrafish fin regeneration. Development 147 (2020).

[5]Wang, W. et al. Changes in regeneration-responsive enhancers shape regenerative capacities in vertebrates. Science 369 (2020).

[6]Ocampo, A. et al. In vivo amelioration of age-associated hallmarks by partial reprogramming. Cell 167, 1719-1733. e1712 (2016).

[7]Lu, Y. et al. Reprogramming to recover youthful epigenetic information and restore vision. Nature 588, 124-129 (2020).