Functional Identification of Corynespora cassiicola-Responsive miRNAs and Their Targets in Cucumber
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2019.00668/full
摘要：【研究目標的重要性】靶葉斑病（TLS）是由棒狀桿菌（C. cassiicola）引起的，是黃瓜（Cucumis sativus L.）中最重要的疾病之一。【研究基礎】我們以前的研究透過高通量測序鑑定了黃瓜中的C. cassiicola響應miRNA，包括兩個已知的miRNA和兩個新的miRNA。這些miRNA的靶基因與次級代謝有關。【研究內容1】在這項研究中，我們透過GUS的組織化學染色和熒光定量分析驗證了這些miRNA與靶基因之間的相互作用。【研究內容2】我們在黃瓜子葉中瞬時表達了候選miRNA和靶基因，以研究對C. cassiicola的抗性。【研究結果1】黃瓜中miR164d，miR396b，Noveal-miR1和Novel-miR7的瞬時表達導致對C. cassiicola的抗性降低，而NAC（被miR164d抑制），APE（被miR396b抑制），4CL（被Novel- miR1）和PAL（被Novel-miR7抑制）導致對C. cassiicola的抗性增強。【研究結果2】此外，4CL和PAL的過表達下調了木質素的合成，【研究結果3】Novel-miR1和Novel-miR7的過表達也下調了木質素的合成，這表明Novel-miR1和Novel-miR7對4CL和PAL的調節可能影響木質素含量。【研究結果4】成功構建了煙草搖鈴病毒（TRV）誘導的短串聯靶模擬物（STTM）-miRNA沉默載體，併成功沉默了靶miRNA。【研究結論】疾病抗性和木質素含量的鑑定表明，沉默候選miRNAs可以提高黃瓜對C. cassiicola的抗性。Introduction黃瓜（Cucumis sativus L.）目標葉片斑點（TLS）是由Corynespora cassiicola（C。cassiicola）引起的，Corynespora cassiicola是專性的卵菌病原體（Teramoto等，2011； Li等，2012）。 TLS影響全世界的黃瓜，包括中國的黃瓜（Li等，2012； Yang等，2012），美國的（Ishii等，2007），日本的黃瓜（Miyamoto等，2010）。和韓國（Kwon et al。，2003）。 TLS是一種葉面疾病，可發生在黃瓜整個生長期，但在生長期的中後期要比其他階段更為嚴重（Wen等人，2015）。 C. cassiicola分生孢子的大小和結構以及菌落的顏色都有很大的差異。這些變異不僅反映在同一菌株的不同菌落中，而且反映在不同地理起源和不同寄主的菌株中（Nghia等，2008； Qi等，2011）。因此，重要的是研究黃瓜對C. cassiicola的抗性分子機制，尋找新的抗性基因資源。
植物微RNA（miRNA）是一類由內源基因編碼的小型非編碼單鏈RNA，主要在轉錄後水平上參與基因表達和調控（Waterhouse and Hellens，2015）。在植物中，miRNA可以透過與靶基因相互作用而發揮功能，主要是透過降解和抑制靶mRNA來實現的（Slack等，2000； Khraiwesh等，2012）。植物在生長過程中經常遭受各種環境壓力。這些脅迫會導致各種物質的積累，並誘導植物相關基因的表達和代謝途徑，從而增強植物的抗性。最近，已發現許多編碼與壓力相關的蛋白質的基因，並且miRNA已顯示在這些基因的表達中具有重要的調控作用（Sanan-Mishra等，2009; Baxter等，2014; Liu等。 ，2015; Zhang and Wang，2015）。病原體感染後可以誘導許多植物miRNA，這些miRNA可以透過與靶標相互作用而參與植物抗病性（Thiebaut等，2015）。 miR393是第一個報道的參與植物與病原體相互作用的miRNA（Navarro等，2006）。在擬南芥中，miR824，miR843，miR852，miR166，miR156和miR159可能對丁香假單胞菌有反應（Zhang等人，2011）。番茄中miR482b的過表達透過抑制NBS-LRR的表達降低了對疫黴菌的抗性，而沉默miR482b則增加了抗性（Jiang等，2018）。在黃瓜中，一些研究已經鑑定出許多與生長和脅迫反應相關的miRNA（Martínez等人，2011; Mao等人，2012; Li等人，2014; Jin和Wu，2015; Burkhardt和Day，2016） ），但目前尚無與C. cassiicola耐藥相關的miRNA的報道。
病原體感染後，植物將產生次生代謝產物來抵抗病原體入侵（Pateraki和Kanellis，2010； Pusztahelyi等，2015）。在植物中，有兩種主要型別的次生代謝產物會影響抗病性。一種是植物固有的物質，例如木質素，call質和角蛋白。這些物質可以增強細胞壁並防止病原體破壞植物組織（Zhao和Dixon，2011）。另一類包括病原體誘導的生物鹼，萜烯和酚。這些物質具有直接的殺菌作用（Agrawal和Weber，2015年）。木質素是細胞壁的重要組成部分，具有複雜的結構和誘導的特性。增加木質素含量可以增強植物細胞抵抗滲透和溶解並抑制病原細菌在植物中擴散的能力（Zhao和Dixon，2011； Li等，2015）。苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）和4-香豆酸酯：CoA連線酶（4CL）是參與苯丙烷合成的兩個關鍵基因。它們可以促進木質素的合成以增強植物的抗病性（Kim和Hwang，2014； Li等，2015）。
在我們之前的研究中，進行了高通量測序，以研究接種C.cassiicola的黃瓜中差異表達的miRNA，包括兩個已知的miRNA（miR164d和miR396b）和兩個新穎的miRNA（Novel-miR1和Novel-miR7）（Wang等）等（2018）。基於對靶基因功能的分析，我們認為這些miRNA在黃瓜和C. cassiicola之間的相互作用中起重要作用。為了進一步闡明黃瓜中的miRNA，有必要有效而準確地證明miRNA與靶基因的相互作用。在這項研究中，候選miRNA和靶基因在菸草中瞬時表達，並且透過GUS組織化學染色和熒光定量分析確定了miRNA與靶基因之間的相互作用。同時，候選miRNA和靶基因在黃瓜子葉中瞬時表達，以研究轉基因黃瓜對C. cassiicola的抗性。透過miRNA的調控，分析了黃瓜對C. cassiicola的抗性機理，為進一步穩定的植物遺傳轉化和育種研究提供了理論參考。
由於miRNA的大小短和家族功能的冗餘，傳統的基因沉默方法不適用於miRNA研究。靶標模擬物（TMs）可以阻斷miRNA對靶基因的抑制，從而抑制miRNA的調節功能（Franco-Zorrilla等，2007； Meng等，2012）。唐等。 （2012年）發現了一種新的miRNA沉默調節機制，即短串聯靶模擬物（STTM），它具有較高的沉默效率，可廣泛用於miRNA的功能研究。 STTM由兩個TM和一個48 nt的連鎖序列組成。在STTM兩側的TM的第10和11個核苷酸之間有3個核苷酸形成凸出，因此，結合位點可以捕獲miRNA，而不會被它們切割。與TM相比，STTM對miRNA具有更好的抑制作用（Yan等，2012）。病毒誘導的基因沉默（VIGS）可以誘導植物內源基因沉默並改變植物表型以探索基因功能（Sha等人，2014）。菸草吵鬧病毒（TRV）是一種RNA病毒，可以感染多種植物。基於TRV的載體具有輕度的感染症狀和高的基因沉默效率（MacFarlane等，1999）。基於TRV的載體已被廣泛用於VIGS中，以抑制多種植物中的基因表達（Bachan和Dinesh-Kumar，2012； Huang等，2012； Zhou等，2012）。但是，黃瓜中尚未報道基於病毒的miRNA沉默（VBMS）。在這項研究中，開發了一種基於TRV的VBMS系統，該系統可以在一段時間內有效抑制黃瓜中的內源性miRNA的活性，並且可以為進一步分析黃瓜對C. cassiicola的抗性機理提供策略。
材料和方法
植物材料
將本氏菸草（N.benhamiana）（本氏菸草）在25℃的溫室中以16：8的光/暗週期種植20天，以進行農業浸潤。 實驗中使用的黃瓜品種是Xintaimici，將其在28°C的溫室中以16：8的光照/黑暗週期種植10天，以進行土壤浸潤。
DNA和RNA提取與cDNA合成
黃瓜葉的DNA使用植物基因組DNA試劑盒（天健，北京，中國）提取。 使用RNAprep純植物試劑盒（天健，中國北京）提取總RNA，並使用QuantScript RT試劑盒（天健，中國北京）合成cDNA。 使用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒（天健，北京，中國）進行與miRNA對應的第一鏈cDNA合成。
候選miRNA及其靶標瞬時表達載體的構建
基於miR164d，miR396b，Novell-miR1和Novel-miR7（補充表S1）的前體序列，根據融合原則設計了引物。同樣，基於NAC，APE，PAL和4CL開放閱讀框序列（補充表S1），引物還根據融合原則進行了設計。引物由GENEWIZ（中國蘇州）合成，並列在補充表S2中。透過BLAST對黃瓜基因組資料庫註解目標基因1。 mRNA原始資料以登入號SRP117262存入NCBI序列讀取檔案（SRA）；小RNA原始資料以登入號SRP117230存放在NCBI序列讀取檔案（SRA）中。
pRI-101 AN（TaKaRa，中國大連）是用於植物轉化的二元載體，可以有效表達外源基因。構建植物表達載體pRI-101 AN和pRI-101 AN-GUS以驗證miRNA與靶標之間的相互作用。為了將cDNA克隆到載體中，使用了InFusion HD克隆試劑盒（Clontech，CA，美國）。透過測序確認所有構建的載體，然後轉化入根癌土壤桿菌（A.tumefaciens）菌株EHA105。
本塞姆氏菸草中候選miRNA和靶標的共轉化
為了驗證候選miRNA與靶基因之間的相互作用，我們透過根癌農桿菌轉化在本氏菸草葉中瞬時表達了構建的載體。 用懸浮緩衝液（10 mM MES，10 mM MgCl2和200μM乙醯丁香酮）將攜帶農桿菌的構建體稀釋至OD600 = 0.5。 將pRI-101 AN-miRNA和pRI-101 AN-GUS靶基因等體積混合以測試tae-miR408的切割功能。 正常菸草（對照）和注射了pRI-101 AN-GUS的菸草用作對照。 滲透48小時後，按照Bradford（1976）和Jefferson等的描述進行GUS染色和熒光定量分析。 （1987）。 所有實驗均進行了三個生物學重複。
TRV誘導的沉默載體的構建
本研究中使用的STTM-miR164d，STTM-miR396b，STTM-Novel-miR1和STTM-Novel-miR7的序列由GENEWIZ（中國蘇州）合成。 STTM引物是根據融合原則設計的，並在補充表S2中列出。 pTRV載體可以在植物中有效表達。 為了將STTM克隆到載體中，使用了InFusion HD克隆試劑盒（Clontech，CA，美國）。 透過測序確認所有構建的載體，然後轉化為根癌農桿菌EHA105。
實時定量RT-PCR分析
使用SuperReal PreMix Plus試劑盒（SYBR Green）（天健，北京，中國）進行基因的qRT-PCR分析，並將黃瓜肌動蛋白基因用作內部對照。 使用miRcute miRNA qRT-PCR檢測試劑盒（SYBR Green）（天健，北京，中國）對miRNA進行qRT-PCR分析，並使用U6 snRNA作為標準化資料的參考。 所有qRT-PCR分析均在LightCycler 480系統（美國羅氏，加利福尼亞州）上進行，所用引物列在補充表S2中。 相對錶達透過2-ΔΔCt方法計算（Livak和Schmittgen，2001），標準差透過三個生物學重複計算。
黃瓜子葉中木質素的測定
木質素含量的測定按照Morrison（1972）的描述進行了一些修改。木質素含量定義為每克鮮重在280 nm處的吸光度。將1 g黃瓜子葉樣品用95％乙醇勻漿，並以5000 rpm離心5分鐘，然後用95％乙醇將沉澱物洗滌3次。將樣品用乙醇和正己烷（1：2，v / v）的混合物洗滌兩次後，透過離心收集沉澱物。將乾燥的樣品溶解在2 mL溴乙醯基和冰醋酸（1：3，v / v）溶液中。在70°C下進行30分鐘的水浴30分鐘後，新增0.9 mL 2 mM NaOH以終止反應。然後，向樣品中加入2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 M鹽酸羥胺，並用冰乙酸將樣品稀釋至5 mL。在5000 rpm離心5分鐘後，收集上清液以確定280 nm的吸光度。
統計分析
所有資料均為三個生物學重複的平均值（±SD）。 使用IBM SPSS Statistics 22軟體透過單向方差分析（ANOVA）進行統計分析，顯著性差異由Duncan的多範圍檢驗確定（P <0.05），並以字母符號表示。
Results結果
候選miRNA與靶基因之間相互作用的驗證
我們之前的研究發現，次級代謝在黃瓜中對卡西氏梭菌感染有重要作用（Wang等人，2018）。 根據先前的研究，選擇了兩個已知的miRNA和兩個具有目標的新型miRNA，因為它們可能與黃瓜中C. cassiicola的抗性增強有關（表1）。 在植物中，miRNA主要透過識別靶基因mRNA上的特定位點並與之結合形成沉默複合體來調節其靶基因，從而抑制靶基因mRNA的翻譯。 候選miRNA和靶基因結合位點如圖1所示。
為了驗證相互作用，我們將候選miRNA和靶基因共轉化為菸葉。我們使用含有GUS基因的載體pRI-101 AN-GUS，透過GUS組織化學染色和熒光定量測試了miRNA對靶基因的抑制作用。正常菸草（對照）和接種pRI-101 AN-GUS的菸草用作對照。 GUS組織化學染色的表型如圖2A所示。
為了驗證相互作用，我們將候選miRNA和靶基因共轉化為菸葉。我們使用含有GUS基因的載體pRI-101 AN-GUS，透過GUS組織化學染色和熒光定量測試了miRNA對靶基因的抑制作用。正常菸草（對照）和接種pRI-101 AN-GUS的菸草用作對照。 GUS組織化學染色的表型如圖2A所示。在用重組載體pRI-101 AN-miRNA（miR164d，miR396b，Nove-miR1和Novel-miR7）和正常菸草（對照）接種的菸葉中未觀察到GUS表型。在接種pRI-101 AN-GUS的菸葉中觀察到GUS表型，而接種pRI-101 AN-GUS靶基因（NAC，APE，4CL和PAL）的菸葉中觀察到GUS表型，其中靶基因融合在GUS基因表現出相似的表型。
然而，在帶有pRI-101 AN-miRNA（miR164d，miR396b，Novel-miR1和Novel-miR7）和pRI-101 AN-GUS靶基因（NAC，APE，4CL和PAL）。共轉化的葉片中，GUS表型顯著降低
透過熒光定量測定法測量接種了不同重組載體的葉片中的GUS蛋白活性（圖2B）。 在普通菸草和接種了pRI-101 AN-miRNA（miR164d，miR396b，Novel-miR1和Novel-miR7）的葉片中未檢測到GUS熒光。 接種pRI-101 AN-GUS和pRI-101 AN-GUS靶基因（NAC，APE，4CL和PAL）的葉片中GUS熒光值增加。 pRI-101 AN-miRNA（miR164d，miR396b，Nove-miR1和Novel-miR7）和pRI-101 AN-GUS靶基因（NAC，APE，4CL和PAL）共轉化的菸葉GUS熒光值 ）確定。 GUS熒光定量分析支援GUS組織化學染色的結果。 這些實驗表明候選miRNA與靶基因之間存在負調控關係。
候選miRNA和靶基因的瞬時表達水平
在這個實驗中，miR164d，miR396b，Novell-miR1，Novell-miR7，Novell-miR1 / Novel-miR7（1：1，v / v），NAC，APE，4CL，PAL和4CL / PAL（1：1， v / v）透過農桿菌浸潤瞬時表達於黃瓜子葉中。 正常菸草（對照）和注射了pRI-101 AN的菸草用作對照。 透過qRT-PCR檢測轉基因黃瓜中候選miRNA和靶基因的表達水平。 結果如圖3所示。在正常菸草和pRI-101 AN實驗組中，基因表達水平相似。 過表達組的基因表達水平明顯高於對照組，這證明瞬時轉化是成功的，可用於進一步的實驗。
候選miRNA和靶基因在黃瓜和C. cassiicola相互作用中的功能
我們進行了黃瓜子葉中瞬時表達的分析，以探索候選miRNA和靶基因在對C. cassiicola的抗病性中的功能。普通黃瓜子葉（對照）和注射了pRI-101 AN的黃瓜子葉用作對照。在進行瞬時表達的農用浸潤後兩天，透過將卡西氏梭菌的孢子懸浮液滴到黃瓜子葉上來收集農用浸潤的子葉用於疾病分析。接種後第5天的疾病表型表明，實驗組miR164d，miR396b，Noveal-miR7和Novel-miR1 / Novel-miR7在C. cassiicola誘導的病變中明顯大於對照組（圖4A， B），表明這些miRNA在黃瓜子葉中的瞬時表達降低了對C. cassiicola的抗性。
然而，在NAC-，APE-，4CL-和4CL / PAL浸潤的葉片上，由卡西氏梭菌誘導的病變明顯小於對照（圖4A，B），表明這些基因在黃瓜中的瞬時表達子葉提高了對C. cassiicola的抗性。 C. cassiicola Actin基因的表達被用作真菌生長的標準。在miR164d-，miR396b-，Noveal-miR1-和Novel-miR7浸潤的葉片中，C。cassiicola的生長顯著高於對照，而NAC-，APE-，4CL-和NAC-中的生長。 4CL / PAL浸潤的葉子明顯低於對照的葉子（圖4C）。此外，Noveal-miR1組的病灶沒有明顯增加，但C. cassiicola的生長卻顯著增加（圖4A–C）。瞬時表達分析表明，候選miRNA的過表達可以降低對C. cassiicola的抗性，而對應於候選miRNA的靶基因的過表達可以提高對C. cassiicola的抗性。這些結果與我們先前的分析一致。
先前的分析表明，Novel-miR1和Novel-miR7可以分別抑制4CL和PAL。 4CL和PAL基因是木質素合成途徑中的兩個關鍵基因，木質素含量與抗病性呈正相關。在此實驗中，Novell-miR1，Novell-miR7，Novell-miR1 / Novel-miR7（1：1，v / v），4CL，PAL和4CL / PAL（1：1，v / v）瞬時表達於黃瓜子葉透過農桿菌滲入。正常菸草（對照）和注射了pRI-101 AN的菸草用作對照。在進行瞬時表達的農用浸潤後兩天，準備了農用浸潤的子葉以測定木質素含量（圖4D）。確定木質素含量以進一步分析候選miRNA和靶基因的過表達對黃瓜子葉木質素積累的影響。如圖4D所示，與對照相比，在4CL-，PAL-和4CL / PAL浸潤的樣品中，木質素含量顯著增加，在Novel-miR1，Novel-miR7-和Novel與對照相比，-miR1 / Novel-miR7浸潤的葉子明顯減少。 4CL / PAL浸潤葉片的木質素含量最高，而Novel-miR1 / Novel-miR7浸潤葉片的木質素含量最低。結果表明，過表達4CL和PAL可以增加黃瓜葉片中木質素的含量，而過表達Noveal-miR1和Novel-miR7可以降低黃瓜葉片中的木質素。
TRV誘導的VBMS
在這項研究中，基於TRV構建了STTM-miR164d，STTM-miR396b，STTM-Novel-miR1和STTM-Novel-miR7重組載體。 STTM結構如圖5A所示。
本研究中使用的STTM-miR164d，STTM-miR396b，STTM-Novel-miR1和STTM-Novel-miR7的序列列在補充表S1中。結構的側面是TM，兩端的限制性酶切位點是EcoRI和SacI。透過In-Fusion技術，將STTM和pTRV2用於構建重組載體。將重組病毒TRV：00（pTRV1 + pTRV2），TRV：STTM-miR164d，TRV：STTM-miR396b，TRV：STTM-Novel-miR1和TRV：STTM-Novel-miR7浸入黃瓜子葉中。接種7天后，接種TRV重組病毒的黃瓜子葉中出現萎黃病和一些病毒斑，但對照和根癌農桿菌EHA105的子葉上未觀察到明顯的表型（圖5B），表明TRV已成功在黃瓜的子葉中複製和繁殖。
為了探索候選miRNA的沉默效果，我們透過qRT-PCR檢測了注射TRV：STTM的黃瓜子葉中候選miRNA和相應靶基因的表達水平。 如圖6所示，TRV：STTM-miR164d，TRV：STTM-miR396b，TRV：STTM-Novel-miR1和TRV：STTM-Novel-miR7浸潤的子葉中候選miRNA的表達水平顯著降低，並且 對應於這些miRNA的靶基因的表達水平上調。 這些結果表明黃瓜子葉中的候選miRNA被成功抑制。
候選miRNA沉默後黃瓜子葉對C. cassiicola的應答
為了確定STTM-miRNA在黃瓜和C.cassiicola之間的相互作用中的作用，我們接種了TRV：00（pTRV1 + pTRV2）-，TRV：STTM-miR164d-，TRV：STTM-miR396b-，TRV：STTM-Novel -miR1-和TRV：STTM-Novel-miR7-浸潤的黃瓜子葉與C. cassiicola一起觀察表型的變化。接種C. cassiicola的5天后，滲透子葉的TRV：00（pTRV1 + pTRV2）的病害與對照子葉之間無顯著差異。但是，C。cassicola誘導的miR164d，miR396b，Noveal-miR1和Novel-miR7沉默的黃瓜子葉的損傷明顯小於對照（圖7A，B）。
透過qRT-PCR檢測了被感染黃瓜子葉中的C. cassiicola生物量（圖7C），
候選miRNA沉默的黃瓜子葉中C. cassiicola Actin基因的表達顯著降低。因此，使miR164d，miR396b，Noveal-miR1和Novel-miR7沉默會增加黃瓜對C. cassiicola的抗性。確定木質素含量以進一步分析沉默候選miRNA對黃瓜子葉木質素積累的影響（圖7D）。
在所有沉默的植物中，尤其是在Novel-miR1和Novel-miR7沉默的植物中，木質素含量均顯著上調。由於4CL（被Novel-miR1抑制）和PAL（被Novel-miR7抑制）是苯丙烷途徑中與木質素合成有關的上游和下游基因，因此這一發現也與我們之前的實驗結果一致。
討論由於miRNA沒有編碼功能，因此它們只能透過抑制或降解相應的靶標來發揮作用。與非生物和生物脅迫相關的基因已被證明是miRNA的靶標，可用於確定miRNA的功能（Jagadeeswaran等，2009； Katiyar-Agarwal和Jin，2010）。在植物中，透過5'RNA連線酶介導的cDNA末端快速擴增（5'RLM-RACE）驗證了miRNA與靶基因之間的相互作用（Llave et al。，2002）。 RACE方法麻煩，並且無法觀察到miRNA與靶基因之間的相互作用。農桿菌介導的菸草瞬時表達高效且表達時間長，適合研究植物中的基因相互作用（Prabu and Prasad，2012; Yin et al。，2017）。該方法主要用於透過檢測菸草中的GUS基因在瞬時表達miRNA和靶基因後的表達來驗證miRNA與靶基因之間的相互作用（Feng等人，2013; Han等人，2016）。
NAC是一種植物特異性轉錄因子，參與植物的發育和植物的脅迫反應。 先前的研究表明，NAC基因家族的許多成員在病原體感染植物後表現出差異表達特性，這表明NAC基因具有對植物抗病性的響應的特定生物學功能（Jensen和Skriver，2014; Qin等， 2014）。 在最近的一項研究中，研究人員分析了與非生物脅迫響應相關的黃瓜NAC基因（Zhang等人，2017）。 但是，關於NAC基因在黃瓜和病原體之間相互作用中的作用的研究很少。 現有資料的BLAST分析顯示，我們鑑定出的NAC基因為csNAC30。 一些研究表明，NAC影響次生代謝產物的合成，但具體機制尚不清楚（Zhao等，2010； Xu等，2015）。
色氨酸不僅促進內源性茉莉酸（JA）的生物合成並觸發植物訊號轉導途徑，而且參與萜類吲哚生物鹼（TIA）途徑，進而調節植物對逆境的反應（Sun等，2016）。 鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉移酶（APE）是色氨酸合成途徑中的重要酶，其間接參與植物次生代謝產物的合成（Dharmawardhana等，2013）
苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）和4-香豆酸酯：CoA連線酶（4CL）是苯丙烷合成途徑中的兩個關鍵基因，與植物對外界脅迫的抵抗力密切相關。 首先，PAL將苯丙氨酸催化為肉桂酸。 然後，肉桂酸參與泛醌的合成，並被4CL催化形成肉桂醯輔酶A。 最後，肉桂醯輔酶A進一步合成了木質素和類黃酮（Kim和Hwang，2014； Li等，2015）。
在分析了目標基因的功能之後，我們選擇了miR164d，miR396b，Novel-miR1和Novel-miR7及其目標基因NAC，APE，4CL和PAL進行相互作用驗證。 GUS基因的組織化學染色和定量檢測表明，相應的miRNA可以抑制這些靶基因，但抑制效率不是100％。 此結果可能有兩個原因。 首先，靶基因的轉錄和核苷酸切割之間存在平衡，並且這種平衡受miRNA表達水平的影響（Nikovics等，2006）。 其次，可能是隻有一部分靶標mRNA被miRNA切割和降解，而其餘的靶標mRNA從切割系統脫離並正常轉錄（Adam等，2010）。
為了探索miR164d，miR396b，Noveal-miR1和Novel-miR7及其靶基因NAC，APE，4CL和PAL在黃瓜對C. cassiicola的應答中的功能，我們在黃瓜子葉中瞬時表達了候選miRNA和靶基因。接種卡西氏梭菌後，觀察到表型變化。由於4CL和PAL是苯丙烷代謝途徑中的上游和下游基因，因此我們共表達4CL和PAL來建立實驗組。類似地，Novel-miR1和Novel-miR7也共表達。圖4顯示，靶基因過表達組的抗病性顯著高於對照組，表明這些基因在黃瓜對卡西氏梭菌的抗性中起重要作用。候選miRNA過表達組的抗病性低於對照組，這可能是因為這些miRNA抑制了其靶基因的表達。透過測量感染後黃瓜子葉中C. cassiicola的生物量也證實了這些結果。資料顯示，共表達的4CL和PAL組具有最高的抗病性，而相應的Novell-miR1和Novel-miR7共表達組的抗病性最低。由於苯丙烷類代謝途徑影響木質素的合成，而4CL和PAL是該途徑中的重要基因，因此在黃瓜子葉中候選miRNA和基因瞬時表達2天后，我們進行了木質素含量測定。圖4D顯示4CL / PAL浸潤的葉片中木質素含量最高； Novel-miR1 /，Novel-miR7-和Novel-miR1 / Novel-miR7浸潤的葉片中的木質素含量低於正常菸草，Novel-miR1 / Novel-中的木質素含量降低更為嚴重miR7浸潤的葉子。 STTM是研究動植物miRNA功能的有效工具。唐等。 （2012年）開發了基於STTM技術的TM。 STTM的過表達已用於鑑定多種植物，例如擬南芥和小麥中的miRNA功能（Jia等，2015； Jiao等，2015），但尚未在黃瓜中報道。為了進一步探索候選miRNA的功能，我們開發了TRV誘導的VBMS使黃瓜內源性miRNA沉默。結果表明，沉默miR164d，miR396b，Noveal-miR1和Novel-miR7可提高黃瓜子葉對C. cassiicola的抗性，表明這些miRNA在黃瓜對C. cassiicola的抗性中起負調控作用。值得注意的是，Novel-miR1和Novel-miR7沉默的黃瓜子葉中木質素含量最高。這些發現還表明Novel-miR1和Novel-miR7及其靶基因之間的相互作用會影響木質素的合成，進而影響黃瓜對C. cassiicola的抗性（圖8）。
結論
在我們的研究中，透過In-Fusion技術構建了表達載體，並透過農桿菌介導的菸草瞬時表達系統驗證了miR164d，miR396b，Novell-miR1和Novel-miR7及其靶標的負相關性。 同時，我們發現NAC，APE，4CL和PAL的過表達可以提高對C. cassiicola的抗性，而miR164d，miR396b，Noveal-miR1和Novel-miR7的過表達可以降低黃瓜的抗病性。 我們證實，沉默候選miRNA可以提高黃瓜的抗病性，並且Novel-miR1和Novel-miR7沉默的黃瓜子葉中木質素含量顯著增加。 這些候選miRNA和靶標與黃瓜木質素合成密切相關，資料與先前的分析相結合證明了次級代謝，特別是木質素代謝途徑在黃瓜對C的抗性過程中的重要作用。