近日，西安交通大學生命科學與技術學院仿生工程與生物力學研究所 (BEBC) 李菲課題組與陝西省人民醫院中醫科姜小帆博士合作開發了一種基於摺紙技術的三維紙基等電聚焦平臺。該平臺可實現蛋白質的分離與富集，既適用於低鹽生理樣品，又可用於高鹽生理樣品（如尿液、血清），並透過與手機成像、側流試紙等檢測方法進一步結合，可實現對實際生理樣品中蛋白疾病標誌物的直接定量檢測（圖1）。
圖1. 三維紙基等電聚焦平臺的設計及其在蛋白分離、富集和分析中的應用示意圖
該工作以醋酸纖維素膜為分離通道的基體材料，色譜紙為儲液池的基體材料，以電池為電源構建了小型化的等電聚焦平臺（圖2a）。為構建三維紙基分離通道，首先透過鐳射切割技術將醋酸纖維素膜加工成二維紙基通道（圖2b），接著對二維紙基通道的菱形區域疏水化處理並保持圓形區域親水（圖2c），最後透過手工摺紙技術將二維紙基通道加工成三維紙基通道（圖2d）。
圖2. 三維紙基等電聚焦平臺的實物圖及分離通道構建過程圖
基於傳統等電聚焦體系難以直接分離、富集高鹽生理樣品中蛋白質的問題，該工作透過最佳化三維紙基等電聚焦平臺中儲液池內的電解質溶液（以去離子水為儲液池中的電解質溶液代替傳統的酸鹼溶液），在高鹽樣本中蛋白質等電聚焦之前首先成功實現了對樣本的除鹽功能（圖3a），之後基於最佳化後的三維紙基等電聚焦平臺，可在12 V的電池驅動下成功完成高鹽樣品（0.9% NaCl）中藻藍蛋白（Phy）、牛血紅蛋白（BHb）和細胞色素C（Cyt C）的等電聚焦過程，實現分離（圖3b, c）。
圖3. (a) 三維紙基等電聚焦平臺分離高鹽樣品的除鹽原理圖；(b) 三維紙基等電聚焦平臺分離高鹽樣品中標準蛋白的結果圖；(c) 等電聚焦後灰度強度隨分離通道位置變化的曲線圖。
為進一步驗證該三維紙基等電聚焦平臺直接分離、富集和檢測生理樣品中蛋白質的可行性，以臨床尿液為樣本，進行了其中微量白蛋白的檢測。檢測過程包括：直接以尿液為三維紙基等電聚焦樣品，等電聚焦後將三維紙基分離通道展開，然後含有白蛋白的獨立紙片被用作微反應器進行了白蛋白的比色定量檢測（圖4a）。基於此方法取得了對尿液中白蛋白6.19 mg/L的檢出限（圖4b），併成功實現了對6例臨床樣本中白蛋白的定量檢測。應用該平臺的檢測結果與臨床檢驗科檢測結果對比的相對偏差小於8.4%。
圖4. (a) 三維紙基等電聚焦後不同濃度白蛋白在醋酸纖維素膜上的顯色結果圖；(b) 白蛋白濃度和灰度強度的校準曲線；(c) 6例臨床樣本中白蛋白的三維紙基等電聚焦和臨床檢驗結果對比圖。
應用三維紙基等電聚焦平臺分離、富集生理樣品中的蛋白質後，紙上的蛋白質可透過簡單的震盪操作收集到水溶液中，透過收集目標蛋白進行離線檢測。整個蛋白回收過程可在5分鐘內完成，回收率達到55.9%-81.3%。基於收集目標蛋白進行離線檢測的方法，該三維紙基等電聚焦平臺與側流試紙進一步結合，實現了對人血清中C反應蛋白的定量檢測。圖5a為不同濃度C反應蛋白的側流試紙顯色結果圖，基於上述結果得到對C反應蛋白0.35 mg/L的檢出限（圖5b）。將此方法應用於臨床血清中C反應蛋白的定量檢測，取得了與臨床檢測結果相比相對偏差小於13.1%的結果。該三維紙基等電聚焦平臺作為小型化的蛋白質分析平臺在現場、快速檢測領域顯示出應用前景。
圖5. (a) 三維紙基等電聚焦後不同濃度C反應蛋白在側流試紙上的顯色結果圖；(b) C反應蛋白濃度和灰度強度的校準曲線；(c) 4例臨床血清樣本中C反應蛋白的三維紙基等電聚焦和臨床檢驗結果對比圖。
該研究成果發表在美國化學會雜誌Analytical Chemistry 上，並被選為雜誌的封面文章。該文章第一作者是西安交通大學博士生牛紀成，通訊作者為西安交通大學李菲教授和陝西省人民醫院姜小帆博士。該文章的其他作者還包括西安交通大學本科生包芷卉、魏子寧，斯坦福線上高中李心澤同學和唐都醫院內分泌科高彬主任等。該工作得到了陝西省自然科學基金、國家高層次留學回國人才基金、中央高校基礎科研基金、中國博士後科學基金、浙江省臨床功能材料與診療器件工程技術研究中心專案和唐都醫院尖子人才基金等的資助。
A Three-Dimensional Paper-Based Isoelectric Focusing Device for Direct Analysis of Proteins in Physiological Samples
Jicheng Niu, Zhihui Bao, Zining Wei, Jasmine Xinze Li, Bin Gao, Xiaofan Jiang*, Fei Li*
Anal. Chem., 2021, DOI:10.1021/acs.analchem.0c04883
導師介紹
李菲
https://www.x-mol.com/university/faculty/13704
課題組介紹
http://gr.xjtu.edu.cn/web/feili