Suppression of nbe-miR1919c-5p Expression in Nicotiana benthamiana Enhances Tobacco Curly Shoot Virus and Its Betasatellite Co-Infection

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7232422/

MicroRNA（miRNA）是非編碼但功能性的RNA分子，長度為21–25個核苷酸。 MiRNA在多種植物生物學過程中起著重要的調節作用。為了弄清nbe-miR1919c-5p與菸草捲曲枝病毒（TbCSV）及其β衛星（TbCSB）DNA的積累以及病毒症狀的發展之間的關係，我們研究了nbe-miR1919c-5p在TbCSV期間的功能。使用PVX和基於TRV的短串聯靶模擬物（STTM）技術在植物中與TbCSB共感染。使用這兩種技術抑制nbe-miR1919c-5p表達可增強本氏菸草植物中TbCSV和TbCSB共感染誘導的葉子捲曲症狀。此外，抑制nbe-miR1919c-5p表達可增強感染植物中TbCSV和TbCSB DNA的積累。我們的結果可以提高我們對TbCSV和TbCSB共感染期間nbe-miR1919c-5p功能的認識。

關鍵詞：菸草捲曲芽病毒，β-衛星，本氏菸草，nbe-miR1919c-5p，microRNA

Introduction

植物microRNA（miRNA）長21–25個核苷酸（nt），是非編碼的小RNA，與mRNA序列結合後可負面調節其靶基因的表達[1]。大量研究還表明，透過調節基因表達，miRNA決定了許多生物學過程，包括激素穩態，葉片形態發生，根系發育以及植物對非生物和/或生物脅迫的反應[2,3,4,5,6,7 ]。

已知植物病毒會引起多種疾病症狀：受感染植物的花葉病，葉片畸形和發育遲緩。最近，植物病毒已顯示出可改變受感染植物中miRNA的表達[7,8,9,10,11,12,13,14,15]。牛瘟病毒是單鏈DNA病毒，經常對許多糧食作物造成巨大的經濟損失[16]。四種截然不同的bemomovirus病毒：非洲木薯花葉病毒（ACMV），捲心菜葉捲曲病毒（CbLCuV），番茄黃葉捲曲病毒（TYLCV）和棉葉捲曲木爾坦病毒及其β衛星（CLCuV / CLCuMB）已顯示出調控作用菸草中十種不同miRNA的表達[17]。由於四種begomovirus病毒對miRNA的調控方式不同，因此推測，不同的miRNA可以控制被感染植物中疾病症狀的不同型別和嚴重程度[17]。

據報道，miR159，miR319和miR172的表達可延緩番茄植株Pusa Ruby中番茄葉片捲曲新德里病毒（ToLCNDV）的感染。類似地，發現這些miRNA的表達在ToLCNDV感染的番茄植株（JK Asha）或辣椒植株中被上調，導致葉片捲曲症狀[18]。這些結果表明miR159，miR319和miR172可能與葉片症狀的發展有關。基於這些發現，Naqvi等人提出miRNA的表達可以用作ToLCNDV感染的分子標記[18]。

然而，Romanel及其同事指出，當前的研究不足以將特定的miRNA與特定的病毒症狀相關聯[19]。到目前為止，尚未在TbCSV和TbCSB（TbCSV / TbCSB）共同感染本氏菸草植物中研究nbe-miR1919c-5p的功能。我們以前的研究表明，多種miRNA在TbCSV / TbCSB共感染本氏菸草植物中差異表達[20]。在這項研究中，我們進一步探索了在TbCSV / TbCSB共同感染的本氏菸草植物中miRNA的表達，並鑑定了下調的miRNA，nbe-miR1919c-5p。我們的結果證實，這種miRNA對於葉片捲曲症狀的形成很重要。

2.1 基因克隆和載體構建

為了研究nbe-miR1919c-5p的功能，使用了基於短串聯靶模擬（STTM）的系統[21,22]。為了構建PVX-M1919載體，用限制酶ClaI和SalI雙重消化含有48個鹼基對（bp）間隔序列的合成DNA。將消化的DNA產物插入到PVX載體的ClaI / SalI位點中，該載體由Chen Jianping Chen教授（浙江寧波）提供，以生產pPVX-M1919。然後用限制酶PstI消化該質粒，並將釋放的DNA片段連線到pTRV-2載體上，該載體也是陳建平教授的禮物，以生產pTRV2-M1919。為了構建其中miR1919c-5p過表達的pGD-OV1919載體，使用引物Pre1919-F和Pre1919-R PCR擴增了miR1919c-5p的前體。用限制性酶HindIII和SalI雙重消化後，將PCR產物插入pGD載體的HindIII / SalI位點，由樊在峰教授（中國農業大學，北京）提供。對構建體進行測序，並分別轉化入根癌農桿菌菌株GV3101。表S1列出了本研究中使用的引物。

2.2。植物生長，病毒接種和農業滲透

本塞姆豬籠草植物在設定為24–26°C和16 / 8-h（明/暗）光照週期的溫室中生長。在三週大的植物上接種了兩種病毒，如先前報道的[23]。簡而言之，將攜帶傳染性TbCSV（分離的Y35）克隆或傳染性TbCSB克隆的根癌農桿菌培養物按1：1（v / v）的比例混合，然後用無針注射器浸入本氏菸草中，如[24]所述。為了進一步分析，分別製備了攜帶pPVX-M1919，pTRV1或pTRV2-M1919的根癌農桿菌培養物。使用攜帶pPVX-M1919的單一根癌農桿菌培養物（稱為PVX-M1919）或同時攜帶pTRV1和pTRV2-M1919的混合根癌農桿菌培養物（稱為TRV-M1919）來敲低nbe-的表達。透過農桿菌浸潤在本氏菸草中的miR1919c-5p。為了測試nbe-miR1919c-5p對TbCSV / TbCSB感染的影響，首先透過農業浸潤法對本氏菸草植物接種PVX，PVX-M1919，TRV或TRV-M1919。將TbCSV / TbCSB在7天后再次接種到PVX-M1919上或用PVX空載體（PVX-CK）處理過的植物接種，而對於TRV-M1919處理過的植物和TRV-CK接種的植物在14天后接種。

2.3。 DNA提取和病毒DNA積累分析

使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法從採集的葉片樣品中提取總DNA [25]。為了確定被測植物中的病毒感染，使用TbCSV或TbCSB特異性引物透過聚合酶鏈反應（PCR）檢測了幼小全身葉片中的病毒DNA [23]。為了量化被感染植物中病毒DNA的積累，我們利用了之前描述的定量PCR（qPCR）方法[26]。然後，使用[27,28]中所述的絕對定量方法計算qPCR的結果。簡而言之，PCR擴增全長TbCSV或TbCSB序列，並將其克隆到pEASY-T1載體（TransGen Biotech，北京，中國）中以產生pT-TbCSV或pT-TbCSB質粒。製備了10倍（109至10份質粒DNA複製）連續稀釋的pT-TbCSV或pT-TbCSB標準稀釋液，並將其用作對照。設計特定的TbCSV（TbCSV-qF / TbCSV-qR）或TbCSB（TbCSB-qF / TbCSB-qR）引物以產生176 bp（TbCSV）或147 bp（TbCSB）擴增子。 TbCSV的每個20 µL qPCR反應均包含10 µL NovoStart SYBR qPCR Super Mix Plus，50 ng DNA模板，0.5 µL TbCSV-qF（10 µM）和0.5 µL TbCSV-qR（10 µM）引物。所得的TbC​SV標準曲線呈線性，迴歸係數R2 = 0.990，計算斜率為-3.441。 TbCSB的每個20 µL qPCR反應均包含10 µL NovoStart SYBR qPCR Super Mix Plus，50 ng DNA模板，2.0 µL TbCSB-qF（10 µM）和2.0 µL TbCSB-qR（10 µM）引物。所得的TbC​​SB標準曲線也呈線性，迴歸係數R2 = 0.990，計算斜率為-3.39。這兩個圖都是使用Origin 9.0軟體根據每個樣品中TbCSV或TbCSB複製數的lg（log10）值生成的。每個qPCR反應使用三個技術重複進行，給出的結果是來自三個實驗的平均值，每個實驗有20株植物。本研究中使用的引物均列在表S1中。