miR403a and SA Are Involved in NbAGO2 Mediated Antiviral Defenses Against TMV Infection in Nicotiana benthamiana

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6679004/

摘要

RNAi（RNA干擾）是針對植物中病毒感染的重要防禦反應。植物中RNAi途徑的核心機制包括DCL（Dicer Like），AGO（Argonaute）和RdRp（RNA依賴性RNA聚合酶）。儘管在擬南芥中證明了這些RNAi成分參與病毒感染反應，但對於菸草-植物-病原體相互作用研究的典範植物本氏菸草（Nicotiana benthamiana），它們對抗病毒免疫的貢獻尚不清楚。在這項研究中，我們調查了本氏菸草NbAGO2基因對TMV（番茄花葉病毒）感染的作用。透過瞬時表達hpRNA構建體使NbAGO2沉默，恢復了GFP沉默的植物中GFP（綠色熒光蛋白）的表達，這表明NbAGO2參與了本氏菸草的RNAi過程。 NbAGO2的表達透過MeSA（水楊酸甲酯）處理和TMV感染進行轉錄誘導。 amiR-NbAGO2瞬時表達下調NbAGO2基因損害了植物對TMV感染的抗性。抑制內源性miR403a（一種預測的NbAGO2調控性microRNA）可減少TMV感染。我們的研究提供了NbAGO2對本氏菸草中菸草花葉病毒家族病毒TMV的抗病毒作用的證據，而SA（水楊酸）透過在TMV感染時誘導NbAGO2表達來介導此作用。我們的資料還強調了miR403a透過調節N.Benthamiana中的目標NbAGO2基因參與了TMV防禦。

關鍵字：本氏菸草，NbAGO2，抗病毒防禦，miR403a，SA，TMV

1. Introduction

病毒疾病威脅著全球的農作物生產和農業。植物進化並發展了複雜的機制來防禦病毒感染。 RNA干擾（RNAi）是植物中的一種抗病毒防禦機制。我們對RNAi用於病毒防禦的理解的歷史可以追溯到1928年，當時Wingard報道了後來的病毒感染可以恢復被病毒感染的植物[1]。隨後，1990年在矮牽牛中報道了RNAi現象，被稱為“共抑制”，後來被稱為轉錄後基因沉默（PTGS）[2]。 1993年，Lindbo等人。在研究轉基因植物中的基因沉默現象時，提出了RNAi的工作機制[3]。 1998年，Fire等人。透過注射雙鏈RNA（dsRNA）使秀麗隱杆線蟲沉默內源性基因表達，因此被鑑定為在RNAi過程中介導序列特異性抑制作用的分子[4]。 1999年，Hamilton和Baulcombe發現25個核苷酸的反義RNA充當RNAi的中間體[5]。 RNAi還存在於真菌和病毒感染的植物中，分別被稱為抑制和病毒誘導的基因沉默（VIGS）[6,7,8]。簡而言之，RNAi機制如下：RNase III家族核糖核酸內切酶Dicer / DCL（類似Dicer）切割出不同來源的dsRNA，以產生長度約為21–24個核苷酸的小干擾RNA（siRNA）。將與靶RNA互補的引導鏈整合到RNA誘導的沉默複合物（RISC）中，其主要成分是PIWI家族的Argonaute（AGO）蛋白。然後，結合RISC的siRNA透過鹼基配對找到目標RNA，並透過AGO蛋白的活性使其降解。 RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp，RDR）透過從一級單鏈siRNA合成二級siRNA來擴增沉默訊號[9]

儘管AGO和Dicer / DCL蛋白均參與RNAi的過程，但它們在針對不同病毒的防禦反應中的功能卻有所不同。此外，植物中有許多AGO和DCL成員，它們顯示出對不同病原體的專門作用。在模型系統擬南芥中，這兩個家族蛋白的功能被大量研究。 AGO1在抵抗諸如蘿蔔cr裂病毒（TCV，Tombusvirus）[10]，黃瓜花葉病毒（CMV，Cucumovirus）[11]，馬鈴薯X病毒（PVX，Potexvirus）[12]和蕪菁花葉病毒（TuMV，Potyvirus）等病毒中起關鍵作用）[13]。 AGO2參與了針對TuMV [14]，TCV，CMV [15]和PVX [16]的抗病毒作用。 AGO4可以抵抗PVX [17]，CMV [18]，甜菜捲曲頂部病毒（BCTV，雙子病毒）[19]和車前草花葉病毒（P1AMV，痘病毒）[20]。 DCL1參與抗核DNA病毒如花椰菜花葉病毒（CaMV，Caulimovirus）的抗病毒作用[21]，而DCL2參與抗TuMV [22]和TCV [23]的作用。 RDR1參與抗菸草撥浪鼓病毒（TRV，Tobravirus）[24]，TuMV [22]和CMV [25]的抗病毒作用。 RDR2有助於植物對TRV [24]和TuMV [22]的反應。在其他植物物種中，RDR1對玉米中的甘蔗花葉病毒（SCMV，波多病毒）[26]和菸草中的PVX和菸草花葉病毒（TMV，菸草花葉病毒）具有抗病毒作用[27]。在水稻中，RDR1和RDR6可以抵抗溴代花葉病毒（BMV，溴病毒）和水稻條紋病毒（RSV，Tenuivirus），但不能對抗小麥矮化雙生病毒（WDV，雙子病毒）[28]。在病毒學模型物種菸草本氏菸草（N. benthamiana，Nb）中，關於AGO和DCL家族蛋白的抗病毒作用報道了一些但有限的研究。 NbDCL4在本氏菸草中對西葫蘆黃色花葉病毒（ZYMV，波多病毒）起關鍵作用[29]。儘管NbRDR1在菸草和擬南芥中均參與抗病毒反應，但在本氏菸草中不起作用[30]。 NbRDR6在本氏菸草中起TCV，PVX和TMV的作用[30]。 NbRDR6還參與植物對馬鈴薯病毒Y（PVY，波多病毒）和CMV的Y衛星的反應，但不參與單獨的TRV或CMV [31]。 AGO蛋白是RNA干擾途徑和RNAi介導的抗病毒機制的關鍵參與者。高等植物編碼許多AGO，但其功能尚不完全清楚。 NbAGO2在擬南芥中的作用得到了廣泛的研究，並且還報道了其在本氏菸草中的抗病毒作用對TBSV（扁桃體病毒），PVX（痘病毒），TuMV（痘病毒）和TCV（扁桃體病毒）[32,33]。因此，我們調查了NbAGO2在RNAi介導的抗病毒作用中對TMV（一種屬於Tobamoviridae的病毒）感染的作用。自從1996年在擬南芥中首次使用以來，人工microRNA（amiRNA）已被用於許多模型和單子葉植物物種，包括水稻（Oryza sativa）和短枝麴黴（Brachypodium distachyon）[34,35,36]。還開發了用於amiRNA表達的基於病毒的表達載體[37]。我們使用amiRNA技術沉默了NbAGO2表達，並研究了其對TMV反應的作用。我們的結果表明，NbAGO2在本氏菸草對TMV的抗病毒反應中起關鍵作用，而miR403a和SA參與了這些反應。

2。材料和方法

2.1。 植物栽培與處理

使用野生型和16c GFP（綠色熒光蛋白）-轉基因（GFP16c）本氏菸草。 野生型本氏菸草由雲南菸草研究所（中國昆明）的Xiaohan Mo教授提供，GFP16c品系由華中農業大學（中國武漢）的Feng Li教授提供。 本塞姆豬籠草種子在滅菌的營養土壤和1：1石（1：1）中生長，生長溫度為22–25°C，光週期為14:10（亮：暗），相對溼度為70％。 三葉期幼苗用於以下實驗。 將0.5mM MeSA（甲基水楊酸）的水溶液噴霧在葉子上，處理後一天收集葉子。 噴塗水溶液作為模擬處理。 為了進行GFP視覺化，用手持紫外線燈在320 nm或尼康SMZ18顯微鏡（日本東京尼康市）下照射TMV-GFP感染的植物。

2.2。 SA含量測定

內源水楊酸（SA）的含量透過紫外可見分光光度法測定。 在60％的乙醇溶液中製備了一組標準溶液，其中包含5、10、20、30和40μg/ mL的SA，其中一種標準溶液用於測量280-320 nm波長內的最大吸收波長 範圍（5 nm間隔），用作後續檢測波長。 最大吸收波長為310 nm，並推導了根據五種標準溶液的吸光度的線性迴歸方程。 收集受TMV和模擬溶液感染的本氏菸草葉，並在五小時後在液氮中冷凍。 將收集的葉片在液氮中研磨並用5 mL 60％乙醇浸泡，離心後的上清液用於檢測310 nm處的吸光度，然後根據標準曲線將其轉換為SA濃度[38]。

2.3 載體構建

2.3.1 hpGFP載體的構建

為了沉默GFP基因，透過正向引物擴增了GFP干擾序列。

5′-TGCGGGATATCGGACGACGGGAACTACAAGA-3′

和反向引物

5′-TGCGGGATATCAAAGGGCAGATTGTGTGGAC-3′

來自GFP16c系的基因組DNA。 透過EcoRV將該片段克隆到pQBV3進入載體中，然後亞克隆到二元載體pCB2004B中，以產生用於插入GFP片段的髮夾構建體。

為了構建基於病毒pCV（CaLCuV）的（捲心菜卷葉病毒）amiR載體，在www.benthgenome.com網站上透過amiR設計功能設計了以下寡核苷酸。

amiR1：

5'-GGATCTAGATTGATCTGAAGGAGCTGAGTTGGAGGGTTTAGCAGGGTGAAGTAAAG-3'

5′-GGAGGTACCTTGATCTGAAGTCGCTGAGTAGAAGAGTGAAGCCATTAAAGGG-3′

amiR2：

5'-GGATCTAGAAAGCTAGGTGGGATAAGTCGTGGAGGGTTTAGCAGGGTGAAGTAAAG-3'

5′-GGAGGTACCAAGCTAGGTGGTCTAAGTCGAGAAGAGTGAAGCCATTAAAGGG-3′

amiR3：

5'-GGATCTAGAGACCACAGGACGCAGAAGATTGGAGGGTTTAGCAGGGTGAAGTAAAG-3'

5'-GGAGGTACCGACCACAGGACTGAGAAGATAGAAGAGTGAAGCCATTAAAGGG-3'。

使用上述引物以擬南芥miR159b為模板骨架來擴增amiR片段，並透過XbaI / KpnI位點將擴增子克隆到pCVA載體中。 透過XbaI / KpnI位點將相同的擴增子克隆到pBI121載體中，以產生基於非病毒二元載體的amiR構建體。

2.3.3 NbAGO2過表達載體（Ox-NbAGO2）的構建

為了過表達NbAGO2基因，透過引物擴增NbAGO2的開放閱讀框（ORF）區。

5′-TACGGATCCATGGATCGTGGAAATTACCG-3′和5′-TCAGAGCTCTCAGACAAAGAACATTTTGAAC-3′從本塞姆氏菸草的cDNA中獲得了BamHI / SacI位點並將其擴增子克隆到pBI121載體中。

為了開發用於miR390a，miR393a和miR403a的STTM（短串聯靶模擬物）構建體，設計併合成了以下序列及其互補序列。 miR390a，5'-ctcgagGGTGCTATCCCCTATCCTGAGCTTGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAATGGTGCTATCCCCTATCCTGAGCTTgaattc-3'；

miR393a，5'-ctcgagCCAAAGGGCTAATAGCATGATGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAATCCAAAGGGCTAATAGCATGATgaattc-3'；

和miR403，5'-ctcgagAGTTTGTGCCTAGTGAATCTAAGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAATAGTTTGTGCCTAGTGAATCTAAgaattc-3'。 限制性核酸內切酶位點以小寫字母顯示，並且STTM間隔序列帶有下劃線。 將寡核苷酸和互補序列退火以產生dsDNA，然後分別透過XhoI和EcoRI將該dsDNA連線到pGreen-GUS-競爭載體中。

2.4。 植物接種，基因沉默和病毒感染

將上述構建體轉化到根癌土壤桿菌GV3101感受態細胞中。 轉化子在28°C下生長至光密度OD600 = 1，透過離心收集細胞並重懸於接種緩衝液（10 mM 2-（N-Morpholino）乙磺酸（MES），10 mM MgCl2、200μM乙醯丁香酮）中。 除非另有說明，否則將農桿菌接種溶液的OD 600值均調節至1.0。 透過無針注射器將接種溶液浸潤到三葉階段的本氏菸草中。 對於基於pCV的沉默實驗，同時將pCVB轉化並與重組pCVA載體共同浸潤。 對於病毒感染，以相同方式感染表達綠色熒光蛋白（TMV-GFP）的TMV感染性克隆pJL24。 對於pJL24，農桿菌接種溶液的OD600值為0.1。 在所有實驗中，將帶有空載體的接種緩衝液用作模擬處理。

2.5。 總RNA提取和cDNA製備

用研缽和研杵將葉組織在液氮中研磨。 將粉末在Trizol試劑（CWBio，北京，中國）中勻漿，並按照製造商的規程提取。 DNase被用於去除汙染的基因組DNA。 總RNA質量透過使用NanoDrop2000分光光度計（ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）和瓊脂糖凝膠電泳測量OD260 / OD280來確認。 將1 µg總RNA用作模板，並使用GoScript逆轉錄系統（美國威斯康星州麥迪遜市的Promega Corporation）透過隨機六聚體合成cDNA。

2.6。 透過qRT-PCR實驗和半定量RT-PCR評估NbAGO2表達

將該cDNA進行PCR實驗。 PCR反應在qTOWER 2.2（Analytik Jena AG，Jena，德國）裝置上進行。 使用快速SYBR Green Master Mix（ThermoFisher Scientific，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）透過qRT-PCR評估NbAGO2水平。 NbAGO2使用引物對5'-ATGTGAAATGGTACGGGCTGAA-3'和5'-CAACAAGGTTCCACTGGCATTT-3'。 作為內部對照，透過引物組5'-CTGACAAGGACAAGGCTGCT-3'和5'-AAGCAGCTCTTCCACCTCTC-3'評估本氏菸草GAPDH基因的穩態水平。 透過2-ΔΔCT方法確定處理樣品和模擬樣品之間的mRNA水平的比率。 進行至少三個生物學重複和兩個技術重複，並透過t檢驗評估差異。

2.7。Northern雜交實驗

透過瓊脂糖凝膠電泳分離10μg總RNA。透過電動毛細管裝置將RNA從凝膠轉移至尼龍膜（Amersham Hybond-N +，帶正電）（GE Healthcare Life Sciences，匹茲堡，賓夕法尼亞州，美國）。透過以前描述的方法制備32P或洋地黃毒苷標記的探針，並按照文獻[39,40]進行雜交和訊號視覺化。對於本氏菸草NbPR1a基因，使用來自本氏菸草序列資料庫（www.benthgenome.com）的轉錄本ID為JN247448的重疊群序列，並使用引物對5'-GGATGCCCATAACACAGCTC-3'和5'-CCTAGCACATCCAAAACGCG-3'。用於擴增313bp探針序列。對於本氏菸草β-肌動蛋白基因，使用部分cDNA序列（JQ256516.1），引物對5'-CCCAAAGGCTAATCGTGAAA-3'和5'-GCAGCTTCCATCATCACACAT-3'用於擴增483bp的探針序列。為了進行TMV檢測，使用編碼衣殼蛋白的核苷酸，並使用引物對5'-CAAGCTCGAACTGTCGTTCA-3'和5'-GACCAGAGGTCCAAACCAAA-3'來擴增352bp的探針序列