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人類腸道定殖了龐大而複雜的微生物群落，這些腸道微生物對人類的健康有重要的作用。人類腸道微生物群落並不是與生俱來的，而是在嬰兒出生以後的生命早期逐步建立和穩定【1, 2】。既有的針對嬰兒腸道微生物組的研究發現，生命早期的腸道微生態的建立過程具有一定的可預測性，其中特定的細菌類群富集在嬰兒的不同階段【3, 4】。雖然早期腸道微生物群落對宿主的嬰兒階段乃至長期的生命健康至關重要，但是我們對於是什麼因素和機制驅動了嬰兒腸道微生物群落的有序建立仍然所知有限【5, 6】。具體來說，宿主因素（妊娠年齡、免疫發生等）、環境因素（分娩方式、營養飲食、抗生素藥物使用等）以及微生物間互作都可能影響早期腸道微生物群落的組成【7, 8】。然而，正是由於各種因素如此複雜，鑑定影響微生物群落變化的任何單一因素顯得非常困難，揭示生命早期塑造腸道微生態關鍵因素的定量研究也十分有限。此外，大多數既有的微生物組研究單著眼於細菌，而忽略了群落中包括真菌和古細菌的其他組分；大部分研究基於微生物類群的相對丰度，而無法測定各類群的絕對丰度：這些技術上的侷限也給定量刻畫影響腸道微生物群落建立的具體因素帶來了制約。

2021年2月24日，哈佛醫學院和波士頓兒童醫院Seth Rakoff-Nahoum團隊在Nature發表了文章Multi-kingdom ecological drivers of microbiota assembly in preterm infants。作者透過開發一種可靠而便捷的測定跨界微生物絕對丰度的實驗方法，詳細描繪了一個早產兒佇列腸道微生物群落中細菌、真菌和古細菌的動態變化；透過構建生態學計算模型，結合體外和體內實驗模型，揭示了特定的界內和跨界的微生物間互作能夠塑造早產兒生命早期的腸道微生物群落的建立過程。

傳統的基於二代測序的微生物組學方法只能測定群落中的相對比例，無法確定一個主要類群相對丰度的上升是因為自身的擴張還是因為其他類群的減少。為了克服相對丰度定量的侷限，作者借鑑了生物學實驗中常用的內參思想，開發了定量新增特定外源微生物的預處理流程，透過標準的核糖體RNA（16S、ITS1）擴增子二代測序，實現了適用於細菌、真菌和古細菌的絕對丰度定量方法MK-SpikeSeq（下圖）。作者使用了一系列的已知驗證性樣本，以及透過對比其他既有的絕對丰度定量方法（DNA總量、流式細胞計數、定量PCR等），證明了MK-SpikeSeq是一種靈敏度高、可靠便捷的絕對丰度定量方法。值得一提的是，這種操作簡便的絕對丰度定量方法不僅適用於腸道微生物群落，也可應用於環境微生物群落樣本。

作者將MK-SpikeSeq跨界絕對丰度定量方法應用於一個包含178名早產兒的前瞻性佇列。既有研究發現，與足月嬰兒腸道中嚴格厭氧菌佔主要成分相比，早產兒的腸道微生物群落表現出成熟度延遲的現象，主要體現為兼性厭氧菌在腸道中要維持更長時間【4, 8】。早產兒佇列的特點體現在高度的臨床相關性，適用於高頻縱向取樣，以及詳細記錄的臨床元資料。作者採集了該佇列中每名嬰兒出生後前六週每隔兩週的糞便樣本，以及其中13名嬰兒前六週的每日糞便樣本，定量刻畫了總計940份樣本的腸道微生物群落組成（下圖）。作者發現早產兒的腸道細菌群落可以大致劃分為四個聚類，其主要類群分別是金黃色葡萄球菌、克雷伯菌、埃希氏菌和腸球菌。有趣的是，這四種聚類與嬰兒的出生方式和營養飲食均沒有顯著相關，而是體現為一種可預測的時間序列：大部分早產兒初期的腸道細菌主要是葡萄球菌，而後逐漸轉變為以克雷伯菌、大腸埃希菌或者腸球菌為主。透過跨界絕對丰度定量，作者發現腸道的細菌和古細菌的載量隨著時間的變化而顯著增加；具體到每個嬰兒的時間序列，絕對丰度顯示的群落動態變化和相對丰度顯示的相比常常有不小的出入，從而凸顯了絕對丰度定量的重要性。相比細菌，早產兒真菌群落的動態變化更加多樣和不可預測，真菌的組分與嬰兒的妊娠年齡也沒有顯著相關。然而，作者透過擬合線性混合效應模型發現，早產兒腸道中細菌和真菌的載量表現出了顯著的負相關性，提示了在腸道微生物群落的動態變化中跨界互作可能發揮了一定作用。

為了定量描述驅動微生物群落動態變化的各種因素，作者使用貝葉斯正則迴歸，將腸道菌群絕對丰度資料和臨床元資料一起擬合到一個高度引數化的廣義Lotka-Volterra（gLV）生態學模型，以預測在群落動態變化中發揮顯著且穩定作用的互作因素。該模型假設每個微生物類群的增長率取決於其內在的生長速度、與同類群其他個體間的互作、與群落中其他類群成員間的互作以及臨床藥物的作用（下圖a）。具體到微生物間互作，gLV模型允許微生物以多種不同方式互作，例如雙向競爭（-/-）、偏害共生（-/0）、單向剝削（+/-）和無相互作用（0/0）；其中各種非對稱的互作模式無法透過傳統的基於相對丰度資料的相關性分析得出，因為相關性分析無法推測互作的方向性。由此，作者構建了一個統計學顯著的界內和跨界的微生物間互作網路，其中包含了早產兒腸道中的前述四類主要細菌和一類真菌念珠菌（下圖b）。這些預測出的微生物間互作和先前觀察到的群落動態變化模式大部分吻合：例如模型推測葡萄球菌可增強嬰兒腸道內克雷伯菌的生長，但自身被克雷伯菌所抑制，這種單向剝削的互作關係符合一些早產兒腸道中由葡萄球菌向克雷伯菌的轉變；又如模型預測念珠菌抑制了克雷伯菌和埃希氏菌，但自身被葡萄球菌抑制，這種跨界的偏害共生的互作關係符合早產兒腸道中細菌和真菌載量的顯著負相關性。

既有的基於計算模型的微生態研究大部分都止步於理論預測，而很少開展實驗驗證。本文中作者從一部分早產兒糞便樣本中分離出相關菌株，進一步透過體外共培養來驗證預測得到的互作網路。體外實驗結果證實了模型鑑定出的所有抑制性互作，包括克雷伯菌對葡萄球菌強有力的抑制效果，以及念珠菌和細菌間的抑制性作用。然而，體外共培養無法重現葡萄球菌對克雷伯菌的增強作用，作者於是猜想這兩種菌的互作模式也許受環境影響，因此進一步探索了小鼠腸道定殖的動物模型。的確，在葡萄球菌先期定殖的情況下，克雷伯菌在小鼠腸道中顯著更快地定殖；而在克雷伯菌定殖腸道後，葡萄球菌的載量也顯著降低了。該體內實驗證實了克雷伯菌和葡萄球菌間的單向剝削關係，更與一些早產兒腸道中觀察到的動態變化模式相吻合。另一方面，作者在唸珠菌和細菌體外共培養實驗中，注意到不同種的念珠菌表現出對細菌不同的抑制性，其中白色念珠菌對克雷伯菌的抑制強度要高於副念珠菌。作者進一步在小鼠動物模型中驗證了這種具有物種特異性的跨界互作關係：白色念珠菌，而不是副念珠菌，顯著降低了克雷伯菌定殖後的載量。

總的來說，本文透過結合絕對丰度定量、生態建模和實驗驗證等方法，證明了早產兒腸道微生物群落建立過程的可預測性可以由界內和跨界的微生物間互作所驅動。作者指出，嬰兒腸道微生態的動態變化和宏觀生態系統的演替之間可能存在共同的生態學機制，其中包含諸如單向剝削和跨界互作等特殊的種間關係；這些符合還原性的微生物間互作機制對理解和最終控制微生物生態系統具有深遠的意義。據悉，文章審稿過程中所有審稿人對本研究均表示了高度評價：審稿人1，the questions are important, the data are solid；審稿人2，the combination of approaches used in this work is rarely accomplished in microbiome work, … this paper represents a big step in a much needed direction for the microbiome；審稿人3，the methodology is original and highly relevant, … the results obtained are novel and important for the understanding of the establishment of the preterm microbiome, as well as for the understanding of microbial ecology in general.

哈佛醫學院和波士頓兒童醫院博士後饒馳通和Katharine Z. Coyte為本文的共同第一作者。

原文連結：

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03241-8

製版人：琪醬

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