我心目中檢測技術史上的幾次革命性發明分別是基於抗原抗體特異性結合原理的免疫標記技術，PCR技術和測序技術。今天我們來聊聊PCR技術，按照PCR技術的演進，人們習慣性的將PCR技術劃分為三代：普通PCR技術，實時熒光定量PCR技術和數字PCR技術。

一、普通PCR技術

KARY MULLIS （1944.12.28-2019.8.7）

Kary Mullis於1983年發明了聚合酶鏈式反應法（polymerase chain reaction ，PCR），據說是載著女友開車的時候，忽然靈光一閃，想到了PCR原理（論開車的好處）。Kary Mullis於1993 年獲諾貝爾化學獎。《紐約時報》如此評價：" 具有高度原創性和重大意義，幾乎將生物學分為 PCR 前和 PCR 後兩個時代。

PCR的原理：在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，透過變性、退火、延伸等步驟，體外複製出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。

普通PCR的優點

經典方法，國際和國內標準齊全儀器試劑成本較低PCR產物可以回收後做其他分子生物學實驗

普通PCR的缺點

容易汙染操作繁瑣只能定性分析敏感性中等存在非特異性擴增，當非特異條帶與目的條帶大小一樣時無法區分

基於毛細管電泳的PCR

針對普通PCR的缺點，一些廠家推出了基於毛細管電泳原理的儀器，將PCR擴增後電泳的步驟在毛細管中完成，靈敏度更高，可以區分幾個鹼基的差異並且透過MAERKER可以計算出擴增產物的含量。缺陷是仍然需要將PCR產物開啟後放入儀器，仍然存在很大的汙染風險。

毛細管電泳圖

二、實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR ，qPCR）技術

熒光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研製出來的一種新的核酸定量技術。熒光定量PCR的發展史是一部ABI、羅氏和伯樂等巨頭的蕩氣迴腸的鬥爭史，感興趣的可以去查查。該技術是目前最成熟，使用最廣泛的半定量PCR技術。

熒光染料法（SYBR Green I）：

SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結合染料，與雙鏈DNA非特異性結合。在遊離狀態下，SYBR Green 發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合，其熒光增加1000倍。所以，一個反應發出的全部熒光訊號與出現的雙鏈DNA量呈比列，且會隨擴增產物的增加而增加。由於染料是與雙鏈DNA的非特異性結合，因此可能產生假陽性的結果。

熒光探針法（Taqman 技術）：

PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發射的熒光訊號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光訊號；PCR擴增時（在延伸階段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光訊號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光訊號的累積與 PCR 產物形成完全同步。臨床檢測中Taqman探針法是最常用的檢測方法。

qPCR的優點

方法成熟，配套儀器試劑齊全試劑成本中等操作簡單檢測敏感性高，特異性高

qPCR的缺點

1.目的基因發生突變導致漏檢

2.低濃度模板檢測結果無法確定

3.使用標準曲線進行定量檢測時誤差較大。

三、數字PCR（digital PCR ，dPCR）技術

數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。相較於qPCR，數字PCR能夠直接讀出DNA/RNA分子的個數，是對起始樣品核酸分子的絕對定量。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了dPCR的概念。

2006年，Fluidigm公司第一個生產商業化的基於晶片的dPCR儀。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系統，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系統，採用高密度的納升級微流控晶片技術，將樣本均勻的分配至20 000個單獨的反應孔中。

2011年，Bio-Rad公 司 推 出 了 基 於 微 滴 的QX100 dPCR儀，利用油包水技術，將樣品平均分配到20 000個微滴油包水中，利用微滴分析儀對微滴進行分析。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR儀，在高壓氣體驅動下，將每個標準反應體系分割成包含100萬至1 000萬個皮升級別微滴的反應乳液。

至此數字PCR就形成了2大派別，晶片式和微滴式。不論是哪種數字PCR，其核心原理都是有限稀釋，終點PCR和泊松分佈。將含有核酸模板的標準PCR反應體系，平均分配成幾萬個PCR反應，分配到晶片或微滴中，使每個反應中儘可能含有一個模板分子，進行單分子模板PCR反應，透過讀取熒光訊號的有或無進行計數，經過統計學泊松分佈的校準進行絕對定量。

下面列舉一下我使用過的幾種數字PCR平臺的特點：

1.Bio-Rad QX200 微滴式數字PCR

伯樂QX200是一個很經典的數字PCR平臺，基本的檢測流程：透過微滴生成儀生成20000個油包水微滴，在普通PCR儀上擴增，最後透過微滴讀取儀讀取每一個微滴的熒光訊號。操作較為複雜，汙染風險中。

2.新羿 TD1 微滴式數字PCR

新羿 TD1是一個國產的數字PCR平臺，基本的檢測流程：透過微滴生成儀生成30000-50000個油包水微滴，在普通PCR儀上擴增，最後透過微滴讀取儀讀取每一個微滴的熒光訊號。該平臺的微滴生成和讀取都在專用的晶片中進行，汙染的風險低。

3. STILLA Naica 微滴晶片式數字PCR

STILLA Naica是一個較新的數字PCR平臺，基本的檢測流程是：將反應液加入晶片，將晶片放入微滴生成擴增系統，生成30,000個微滴單層平鋪於晶片中，PCR擴增在晶片上完成。然後將擴增後的晶片轉移至微滴閱讀分析系統，採取拍照的方式讀取熒光訊號。由於整個過程在封閉的晶片中進行，汙染的風險較低。

4.ThermoFisher QuantStudio 3D 晶片式數字PCR

ThermoFisher QuantStudio 3D是另一個經典的晶片式數字PCR平臺，其基本的檢測流程是：將反應液加入到塗布器中，透過塗布器將反應液均勻塗布在有20000個微孔的晶片上，將晶片放在PCR儀上擴增，最後將晶片放入讀取儀中採取拍照的方式讀取熒光訊號。操作較為複雜，整個過程在封閉的晶片中進行，汙染的風險較低。

5.JN MEDSYS Clarity晶片式數字PCR

JN MEDSYS Clarity是一個較新的晶片式數字PCR平臺，其基本的檢測流程是：將反應液加入到塗布器中，透過塗布器將反應液均勻塗布在固定在PCR管中有10000個微孔的晶片上，反應液透過毛細管作用進入晶片，將帶有晶片的PCR管放在PCR儀上擴增，最後將晶片放入讀取儀中採取拍照的方式讀取熒光訊號。操作較為複雜。汙染的風險較低。

彙總各數字PCR平臺的引數如下：

數字PCR平臺的評價指標有：分割單元數，熒光通道數，操作複雜性和汙染風險。但是最重要的是檢測準確性，評估數字PCR平臺的一種方法是使用多個數字PCR平臺互相驗證，另一種方法是使用定值準確的標準物質。

dPCR的優點

實現絕對定量更高的敏感性和特異性可以檢測低複製樣品

dPCR的缺點

1.儀器裝置和試劑昂貴

2.操作複雜，檢測時間長

3.檢測範圍較窄

目前三代的PCR技術各有各的優缺點，也各有各的應用領域，並不是一代取代一代的關係。技術的不斷進步給PCR技術注入了新的活力，使其能解鎖一個又一個的應用方向，使核酸檢測更方便、更準確。

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