近年來，作者開發了肽嵌入的磷酸蘇氨酸（pThr）作為新型的CPA催化劑。為了評估這些CPAs影響不對稱磷酸化的能力，作者從鳥苷亞磷醯胺1 [~3：1dr]和腺苷衍生物2（圖2A）的2'到5'偶聯開始探索。事實上，簡單的磷酸都能催化1和2的偶聯，提供P(III)二核苷酸中間體，然後用t-BuOOH對其進行立體保持氧化，便可得到所需的立體異構磷酸酯3。於是作者考察了兩類CPAs，並將結果與二苯基磷酸（DPP）進行了比較，後者是一種非手性催化劑，用於標定手性底物固有的選擇性。結果顯示pThr衍生的催化劑傾向於β-轉向結構且對i+1和i+2位置分別具有DPro和Aib的催化劑表現出了選擇性（圖2A）。值得一提的是，催化劑P3（20 mol％）能以77％的收率和85：15 dr值得到產物，擴增了SP非對映異構體（相對於DPP獲得的77:23 dr）。對催化劑結構的進一步修飾並未導致選擇性（P4-P8）的大幅增加。但是，將反應濃度降低到0.04 M時，選擇效能提高到91：9 dr；將反應溫度降低至4 ℃時，能以79%的分離收率和94∶6的dr值得到目標產物。此外，將反應放大至0.05 mmol規模時，仍能以67％的收率和88:12 dr值得到產物。

鑑於P-立體異構性對基於寡核苷酸治療劑的功效有重大影響，作者尋求了一種互補的、立體發散的磷酸催化劑——基於C2對稱BINOL骨架的CPA。最初，作者在標準反應條件下對（R）-TRIP（B1）進行了評估，以26％的收率和45:55 dr值獲得了二核苷酸3（圖2B），且略微偏向於RP非對映異構體。當使用（S）-B1作為催化劑時，收率和選擇性均顯著提高（收率：74％；dr 值：8:92）。經過一系列篩選，發現（S）-B7效果最好（收率：63%；dr 值：1:99），而（R）-B7的選擇性則較差（43:57 dr），但仍能提供RP非對映異構體。這些結果表明兩種不同的催化劑骨架（pThr和BINOL衍生的CPA結構）使得不對稱亞磷醯胺偶聯表現出顯著的立體發散性。

類似於1H-四唑機理，作者認為磷酸催化劑在質子向二異丙胺轉移的過程中既充當酸，又充當親核試劑（圖1D）。為了驗證這一假設並探討機理，作者透過反相色譜法分離了亞磷醯胺非對映異構體（1，圖2C），並將所得的純亞磷醯胺（1Fast 和1Slow）置於各種催化劑（P3、（S）-B7和DPP）的最佳反應條件下。結果顯示二核苷酸3的立體化學與1的起始dr值無關，這是因為催化劑能以相同的非對映選擇性將1的非對映異構體轉化為（RP）-3或（SP）-3。

接下來，作者探索了該反應的底物範圍（圖3）。例如用t-BuOOH處理中間體亞磷酸酯便可得到磷酸酯3，而使用苯乙醯基二硫化物（PADS）進行硫化時便可得到PS 4。值得一提的是，將反應濃度提高到0.40 M時，（S）-B7的負載量可低至5 mol％，並以57%的收率和98：2 dr值得到（SP）-4。除了異亞丙基腺苷（3），脫氧腺苷（5）和C2'-氟-脫氧腺苷（6）也能很好地耐受該反應，並觀察到類似的非對映發散性。當將2',3'-未保護的腺苷用作親核偶聯配偶體時，在（S）-B7的作用下實現了高位點選擇性和非對映選擇性的磷酸化，並在單偶聯產物的五種可能異構體中選擇了一種單一的產物（7）。相比之下，當用DPP作為催化劑時，得到的是複雜的產物混合物（圖3B）。其它的核糖核苷（8-10）也可以高產率和選擇性與鳥苷1進行偶聯，而其它的亞磷醯胺（11和12）與鳥苷1進行偶聯時，選擇性卻降低了。這些結果表明非對映發散性催化可以應用於其它核鹼基對。

為了解決先前方法存在的問題（如化學計量的活化劑、合成效率低），作者以催化劑控制的方式製備了立體純CDNs。為此，他們使用這種新開發的方法在1和13之間進行立體選擇性的亞磷醯胺偶聯，然後進行H-膦酸酯大環化以獲得具有所需磷立體化學的PS16（圖4）。最初，在最佳化的條件下，1和13•Et3N偶聯的選擇性並不好（圖4A）。在沒有手性催化劑的情況下顯示出快速的非選擇性背景反應，這很可能是由於三乙銨陽離子（pKa（DMSO）= 9.0）促進的自催化作用勝過了催化過程。為了規避這種自催化作用，作者透過離子交換製備了一系列鹼金屬膦酸鹽並評估了它們的效果。當在無催化劑的情況下用13•Na進行反應時，24h後的產率為23％，而13•Et3N為46％，這表明背景反應被抑制。使用先前最佳化的催化劑，作者發現選擇性取決於抗衡離子和催化劑的結構。當使用pThr催化劑P3時，發現Cs+膦酸酯鹽對RP非對映異構體14的選擇性最高（10:90 dr）。此外，當使用13的Li+鹽進行反應時，發現催化劑（S）-B8對SP非對映異構體的選擇性最高（74:26 dr）。由於Li+鹽在反應條件下的溶解度增加，因此在4 °C下使用MeCN/DMF進一步提高了選擇性（77:23 dr）。

為了完成立體純CDNs的合成，作者在簡單的結晶後將1和13•Cs以3.0 mmol規模在P3下進行偶聯，分離出>2g的粗製（RP）-14。然後用三氟乙酸水溶液在C5'處對乙矽烷進行位點選擇性水解，在快速色譜分離後以兩步30％的收率和1:99 dr值得到大環化前體（RP）-15。後者在2,6-二甲基吡啶為鹼、20 mol％ N-甲基咪唑（NMI）為親核催化劑、二氯甲烷為溶劑的條件下與二苯基磷醯氯反應，可以21%的分離收率和優異的非對映選擇性（> 90:10 dr）得到（RP，RP）-16。經整體脫保護後，CDN 2',3'-cGSASMP [（RP，RP）-17]透過丙酮結晶，最終以75%的收率分離出單一的非對映異構體。當使用（S）-B8作為催化劑和13•Li反應時，也可以透過相似的順序以高選擇性獲得（2'-5'）SP，（3'-5'）RP非對映異構體（圖4C）。此外，作者透過測量HPLC洗脫順序確定了（RP，RP）-17和（SP，RP）-17中磷的相對立體化學構型。也就是說，肽衍生的催化劑P3選擇（RP）構型的PS，而BINOL衍生的催化劑（S）-B7和（S）-B8選擇（SP）構型的PS。因此，類推地確認了2',5'-連線的二核苷酸底物（3-10和12）的相對構型（圖3）。

總結

本文報道了基於肽骨架和C2對稱BINOL衍生骨架的CPAs催化的磷醯胺偶聯反應，並充分控制了P（III）的立體化學。這些催化劑還能用於CDNs的立體控制合成，從而實現了這些化合物的簡潔合成。總體而言，每一類催化劑以及CPA框架本身都明確提供了一種新的催化方法，用於合成P-立體異構核苷酸衍生物，具有重要的應用價值。

Catalytic asymmetric and stereodivergent oligonucleotide synthesis

Aaron L. Featherston, Yongseok Kwon, Matthew M. Pompeo, Oliver D. Engl, David K. Leahy, Scott J. Miller

Science, 2021, 371, 702-707, DOI: 10.1126/science.abf4359

導師介紹

Scott J. Miller

https://www.x-mol.com/university/faculty/1299