受體酪氨酸激酶c-MET(以下簡稱MET)的功能失調已被證實是腫瘤發生的驅動因素。與許多其他原癌基因相比，MET的顯著特點是三種不同型別的基因突變均可導致腫瘤的發生，包括擴增、突變和融合等。隨著MET驅動突變癌症的診斷和治療的迅速發展，《自然評論臨床腫瘤學》（Nature Reviews Clinical Oncology）發表一篇關於MET基因的綜述文章，系統闡述了MET驅動突變癌症的臨床特徵、診斷策略和靶向治療方案1。

一、MET擴增

MET擴增即MET複製數擴增，包括整體染色體重複和區域性區域基因的重複整體染色體重複即多倍體（polysomy）腫瘤細胞中出現多條7號染色體，多倍體在生物學中不能作為驅動基因。擴增是區域性或區域基因的重複，斷裂-融合-橋連機制是導致基因擴增的主要原因。與多倍體比較，MET擴增可能作為驅動基因，也是EGFR-TKI耐藥的主要機制之一。MET基因複製數為連續變數，陽性閾值的定義會影響發生率、與其他基因亞型重疊率，及作為MET抑制劑療效預測指標的能力。如下介紹MET擴增的診斷、臨床特徵和治療等。

| ET擴增檢測

MET擴增可使用多種技術檢測，包括熒光原位雜交（FISH）、實時定量PCR（qRT PCR）和二代測序（NGS）（見圖1）。

熒光原位雜交（FISH）

FISH是一種常用的檢測技術，其基本原理是利用熒光基團偶聯標記的DNA探針來識別特定序列的基因組區域，常用於福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織切片標本的檢測。當待探測的基因組序列暴露於熒游標記的探針後，會發出相應顏色的熒光。熒光訊號的數量則代表了了基因的複製數。

FISH主要有兩種主要方式來檢測MET擴增。第一種方法直接測定MET基因複製數(GCN)。目前臨床研究採用最多的是Cappuzzo標準，即平均每個細胞有5條及其以上MET基因複製數(MET GCN ≥5)可視為MET擴增，也有其他學者建議平均複製數≥6個甚至15個才能定義為MET擴增。遺憾的是這種透過複製數來確定擴增的方法並不能區分是多倍體還是區域性擴增。第二種方法將MET/CEP7≥2.0作為MET擴增標準，這是目前最廣為接受的標準。也有學者根據MET/CEP7值將擴增程度分為三組：低度擴增(1.8 - 2.2)、中度擴增(2.2 -5)和高度擴增組(≥5)。

二代測序（NGS）

與適用於FISH的標準相似，對於MET擴增的單一定義沒有達成共識。目前大部分平臺均使用讀取深度（read depth）測定法，這種方法基於讀長深度的訊號與樣本中染色體片段的複製數成比例的原理，並使用一些生物資訊學方法進行計算，然而在敏感性和特異性上還是有一定侷限。有的平臺還會使用同一患者來源的良性組織或者血液樣本作為對照以進一步提高敏感度，NGS的優勢在於除了能夠同時評估數百個基因的變異外，還具有高解析度和從眾多的複製染色體中識別區域性基因擴增的能力。臨床上有兩種基於NGS的檢測方法：基於擴增子的NGS和基於捕獲的NGS技術（見圖1a、1b）。

圖1.MET擴增腫瘤診斷

| 臨床病理特徵

原發MET擴增

在多種實體瘤中都發現有原發MET擴增，根據腫瘤基因組計劃（TCGA）和cBioPortal資料庫提供的資料，MET擴增比較典型的有非小細胞肺癌(NSCLC) ，檢出率約＜1-5%；胃癌中約＜1-10%；大約2-4%的結腸癌（CRCs），13%左右的I型腎乳頭狀癌(PRCCs)和3%左右的II型腎乳頭狀癌也檢出MET擴增，在食管癌和肝細胞癌中檢出比例較低。在許多惡性腫瘤中MET擴增意味著預後不良。研究發現NSCLC細胞MET擴增度越高，腫瘤的MET驅動依賴性越強。MET高度擴增 (MET /CEP7 ≥5，FISH法)的 NSCLC患者，很少合併其他致癌基因的驅動改變（比如EGFR突變或者ALK融合），而在MET低度擴增（MET / CEP7 ≥1.8 , ≤2.2，FISH法）和中度擴增 （MET / CEP7>2.2 ，<5，FISH法）的患者中，更多合併有其他驅動基因改變（MET高，中，低度擴增合併其他驅動基因改變比例分別為0%，52%，50%）。

獲得性MET擴增

MET擴增可以是原發的也可以是被其他原癌驅動基因（EGFR）次級啟用，這也是EGFR等TKI耐藥機制之一。根據不同的檢測方法和平臺提供的資料，在接受一到三代EGFR TKI靶向治療後的NSCLC患者中大約5%~20%的比例會出現MET擴增。EGFR突變的腫瘤細胞可以繞開EGFR TKI（吉非替尼或者厄洛替尼等）作用的PI3K通路，啟用MET這一旁路訊號通路，而PI3K通路也可以透過MET介導的HER3訊號通路進一步啟用。MET擴增也被發現是ALK融合陽性NSCLC癌患者對ALK抑制劑耐藥的機制之一。此外，在接受抗EGFR單克隆抗體治療的結腸癌患者和接受EGFR和BRAF抑制劑聯合治療的BRAF V600E突變的結腸癌患者中也可檢測到MET擴增。當患者接受EGFR TKI治療後MET擴增的次級啟用即可發生，這種啟用也可以發生在腫瘤細胞的的亞克隆群中。當使用NGS檢測的樣本混合有MET擴增和非MET擴增的腫瘤細胞時該結果可能會低估MET的擴增程度，為了進一步提高準確度，建議可以聯合FISH或者單細胞測序進行補充。

| 靶向治療

MET擴增水平和MET抑制劑療效呈正相關。

1）原發性MET擴增

PROFILE 1001研究是最早開展的關於MET抑制劑療效和MET擴增程度相關性的研究。患者分別分為低度擴增組（MET / CEP7 ≥1.8 , ≤2.2），中度擴增組 （MET / CEP7>2.2 ，<5）和MET高度擴增組 (MET /CEP7 ≥5)，結果提示高度擴增組的客觀反應率(ORR)可達67%，低擴增組和中擴增組的客觀反應率ORR分別為0%和17%。隨後研究組將中度擴增組界定值調整為MET /CEP7值為2.2-4.0，高擴增組界定為MET /CEP7 ≥4.0，最終結果提示總體臨床獲益最顯著的也是高度擴增組，其ORR為40%，中位無進展生存期(PFS)為6.7個月，而低度擴增組和中度擴增組的ORR分別為33%和14%，PFS分別為1.8個月和1.9個月（圖2）。

圖2.MET擴增腫瘤患者的靶向治療及其有效性

2）獲得性耐藥

對於依賴於另一驅動基因且出現MET次級啟用的腫瘤患者，針對原發驅動基因和MET訊號通路的聯合治療可能有效。例如EGFR突變的患者在使用EGFR TKI後耐藥進展，如果是MET擴增導致的耐藥，那麼聯合使用EGFR TKI和MET抑制劑可能是行之有效的方案。研究揭示對於EGFR突變伴隨MET擴增耐藥（FISH或者NGS檢測結果為MET /CEP7≥2或者GCN≥5）的患者使用奧西替尼和沃利替尼聯合治療的ORR可達30%。另一項研究提示接受一/二代EGFR TKI治療的患者出現MET擴增耐藥，接受吉非替尼和特泊替尼聯合治療，其ORR可高達67%。其他藥物比如EGFR和 MET雙特異性抗體JNJ-372，在EGFR耐藥進展的患者中也表現出了良好的活性，這些藥物在繼發MET擴增的惡性腫瘤中的療效會有更多研究揭曉。

總而言之，高MET擴增水平預示著使用MET抑制劑會有更好的療效，這種預測模式對於MET抑制劑單藥使用或者MET與其他TKI聯合治療都有預測意義。因此我們再次呼籲儘快實現對MET擴增的標準化定義，不僅僅是為了達到診斷意義，也是為了儘可能識別出MET改變驅動的惡性腫瘤患者並區分其擴增程度，讓其從針對MET的靶向治療獲益。

MET突變

啟用突變可發生在MET基因不同位置，包括激酶結構域、外顯子14側翼的內含子剪接位點和細胞外結構域（見圖3）。

圖3.MET突變

激酶結構域突變

1997年首次在遺傳性乳頭狀腎細胞癌（PRCC）患者中發現MET突變，這些胚系突變包含V1092I、 H1094R/Y、M1131T、V1188L、V1220I、M1250T和D1228H/N/V。MET激酶結構域突變增加激酶活性，導致表型轉化或腫瘤灶的形成。除了原發性突變，MET激酶活性區也能發生EGFR TKI耐藥的繼發性突變，在非小細胞肺癌中，研究發現MET外顯子14、METY1230C、METY1230H、METD1228H 和METD1228N均能介導克唑替尼的耐藥。

MET 14外顯子突變

MET啟用導致MET激酶活化環內由外顯子14編碼的近膜結構域的Y1003殘基磷酸化。該殘基的磷酸化介導MET與c-Cbl E3連線酶結合，導致泛素化並最終降解MET，作為自我調節負反饋環的一部分。在這個過程中，所有的外顯子突變都會受到持續的干擾。

| MET突變檢測

DNA測序：MET外顯子14跳躍突變具有高度的異質性，因此，一個有效的NGS分析必須能夠捕捉到這種廣泛多樣的突變。如前所述，NGS法分為擴增法和雜交捕獲法，擴增法使用引物來檢測基因組區域目的基因序列，與雜交捕獲法相比，這種方法可以縮短檢測時間，對一些難以測序的區域有更好的捕獲，但對於有重複、偏倚和等位基因丟失等區域容易出現測序失真。一些MET EX14突變比如鹼基插入/缺失突變，通常位於擴增區域之外，檢測可能會被遺漏。此外鹼基插入/缺失突變可能會干擾引物和位點的結合，進而干擾基於引物的擴增法對其進行檢測。不少研究表明相當大比例的MET EX14（50%的比例）使用擴增法NGS可能出現假陰性結果。

RNA 測序：DNA測序只能透過檢測外顯子突變來預測MET外顯子跳躍突變，突變發生在轉錄後的剪接。因此RNA測序彌補DNA測序的不足。然而，RNA的穩定性不如DNA，這限制了組織的儲存期限。此外，鑑於mRNA表達在非惡性組織和腫瘤組織中高度變異性，對檢測結果的解讀帶來挑戰。目前是RNA測序作為傳統測序的輔助手段，如確認MET外顯子14跳躍。綜上所述，雖然MET 14外顯子表達的突變可能難以用基於DNA測序平臺來檢測，但可以透過RNA測序來直接確定14號外顯子是否被轉錄。

| 靶向治療

激酶結構域突變：MET靶向治療對某些MET激酶結構域突變是有效的。然而，各種MET-TKIs對特定突變的活性是有差異的。具體地說，II型MET抑制劑，如卡博替尼和foretinib，對幾種激酶結構域突變（如D1228N、M1250T和H1094Y/L145）具有臨床前活性，而I型MET抑制劑，如克唑替尼，對引起這些突變的腫瘤缺乏任何實質性活性。因此，MET激酶結構域突變已成為MET擴增和MET外顯子14跳躍突變的癌症患者對克唑替尼的耐藥機制。

MET外顯子14跳躍突變：與能夠改變MET激酶構象的激酶結構域突變相反，MET外顯子14跳躍突變理論上同樣均有與野生型MET相似的激酶結構域。Ⅰ型和Ⅱ型MET-TKIs都能抑制這種變異體，而且這兩種型別在MET外顯子14跳躍突變的癌症模型中都顯示了臨床前活性。前瞻性的臨床研究證實克挫替尼（Ia型MET抑制劑）針對MET外顯子14跳躍突變的NSCLC有效（ORR 32%），並且Ib型MET抑制劑卡馬替尼、特泊替尼和沃利替尼也對MET外顯子14跳躍突變有很好的療效（見表1）。

表1. MET外顯子14跳躍突變肺癌的靶向治療

MET融合

MET是最初在化學轉化骨肉瘤細胞系中發現含有TPR–MET融合後被鑑定為癌基因。隨後在胃癌、甲狀腺癌、PRCC、肺腺癌、肝癌、膠質瘤和肉瘤患者中發現MET融合。融合的確切頻率尚不明確，儘管它們在膠質瘤中豐富，發生在約12%的患者。除TPR-MET外，還發現了多個其他MET融合（見圖4）。這些融合可以透過染色體內融合（如PTPRZ1–MET、CLIP2–MET、CAPZA2–MET和ST7–MET）或染色體間融合（如KIF5B–MET，TPR–MET，GPRC5C–MET和CD47–MET），每種型別約佔所有MET融合的一半。在患有膠質母細胞瘤的兒科患者中，染色體內融合似乎更為常見最常見的是PTPRZ1。

MET融合通常包括該基因的15外顯子，該外顯子編碼激酶域，而許多上游伴侶基因編碼二聚體結構域，導致配體無關的連線性MET啟用。此外，一些融合事件（如TPR–MET）被發現排除了外顯子14，從而使得MET啟用機制類似於MET外顯子14跳過的機制。有趣的是，包含外顯子14的融合（如KIF5B-MET和PTPRZ-MET）似乎比排除外顯子14的融合更不易致癌。在PTPRZ-MET融合中，PTPRZ啟動子通常與全長MET基因融合，包括外顯子2上的MET二聚結構域，這種融合導致MET過表達和下游訊號的啟用增加。

圖4.MET基因融合

| MET融合檢測

多種分析技術可用於檢測MET融合，包括FISH、RT-PCR和NGS。然而，這些平臺都沒有在這一應用中得到了很好的研究，而複雜的和/或新的MET融合和重排特別難用FISH來檢測。因此目前越來越關注NGS，這是臨床上檢測基因變異的首選方法。基於DNA的NGS能夠可靠地檢測各種MET融合。雖然DNA-NGS檢測基因融合也存在著侷限性，如融合斷點發生在重複的內含子區域；內含子區域太長，不易設計引物；檢測新的融合基因伴侶也有限。正與前面提到的，這些不足之處都可以透過RNA-NGS檢測來避免。在一項研究中，DNA-NGS檢測為驅動基因陰性的NSCLC佇列，用RNA-NGS檢測，發現12%的患者存在驅動基因融合2。這一研究結果表明，在MET融合基因檢測上，RNA-NGS可以補充基於DNA的NGS檢測，特別是在無驅動基因突變的情況下。

| 靶向治療

迄今為止，MET靶向治療在MET融合陽性癌症患者中的作用幾乎被忽視。MET TKIs在TPR-MET轉化細胞系中能夠誘導細胞凋亡，在MET融合陽性的肺腺癌或神經膠質瘤病例中，已經報道了克唑替尼有效。目前正在進行多項旨在評估MET TKIs療效的臨床試驗，包括對伴有MET融合的腫瘤患者的試驗(NCT02978261, NCT03993873和NCT01639508)。然而，MET TKI的療效在一個大的同質的MET融合陽性的佇列中尚未被報道。

MET過表達

MET可在缺氧和/或炎症條件下轉錄誘導癌細胞增殖，減少凋亡，促進轉移。因此，即使在缺乏諸如MET擴增、突變或融合等基因組驅動因素的情況下，腫瘤也可能依賴MET訊號。關於MET過表達的診斷和治療如下：

| MET過表達檢測

免疫組織（IHC）：許多抗MET抗體已被用於免疫組化（IHC）檢測。這些包括單克隆抗體（如SP44、cMET和MET4）、多克隆抗體（如多克隆MET AF276）和磷酸化MET抗體（如pMET Y1349）。病理學家評估的IHC染色的程度和強度提供了MET蛋白表達半定量指標。IHC使用各種評分系統來定義MET表達和過表達。

質譜法（Mass spectrometry）：選擇反應監測質譜法（SRM-MS）能在福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片中定量測定MET，結果重現性好，即使在固定時間≥1年的樣本中也是如此。與IHC相比，SRM-MS不易受到觀察者間偏差的影響，並且可以檢測較低水平的蛋白質表達。SRM-MS不能區分腫瘤和非惡性組織中表達的蛋白質，因此MET定量可能受到混合基質和/或炎症浸潤的影響。此外，SRM-MS比IHC技術要求更高，成本也更高，這意味著目前這種方法的應用不太廣泛。IHC目前通常用於診斷病理學實驗室，而SRM-MS的使用在很大程度上仍處於研究階段。

| 靶向治療

目前，MET-TKIs在MET過表達的腫瘤患者中幾乎沒有活性（表2），慶幸的是，新的MET靶向治療策略正在開發，如雙特異性抗體，抗體組合和ADC等。

表2. 根據MET表達狀態進行靶向治療的結果

結論

鑑定MET驅動突變癌症患者的過程很複雜。從診斷的角度來看，需要對連續變數(包括MET擴增水平或MET表達水平)標準化成具有臨床意義的閾值，然後這些特徵才能用來指導治療相關的決策。為了最大限度地提高檢測MET擴增、突變和/或融合的可能性，可能需要將診斷學轉向使用更全面和技術複雜的檢測方法。應該考慮用NGS方法同時檢測腫瘤活檢和血漿樣本中DNA和RNA水平的變異。鑑於MET靶向治療在許多此類癌症中非常有效，因此有效檢測MET驅動突變癌症至關重要。

參考資料：

1.Robin Guo, Jia Luo, Jason Chang,et al.MET-dependent solid tumours — molecular diagnosis and targeted therapy.Nature Reviews Clinical Oncology volume 17, pages 569–587(2020).

2.Benayed, R. et al. High yield of RNA sequencing fortargetable kinase fusions in lung adenocarcinomas with no mitogenic driver alteration detected by DNA sequencing and low tumor mutation burden.Clin. Cancer Res. 25, 4712–4722 (2019).