近日，中國農業大學生物學院/植物生理學與生物化學國家重點實驗室李繼剛教授課題組在aBIOTECH線上發表了題為A LexA-based yeast two-hybrid system for studying light-switchable interactions of phytochromes with their interacting partners的研究論文。該研究建立了基於LexA的酵母雙雜交體系，可用於檢測光敏色素與訊號分子之間的光可逆互作。

光敏色素 (phytochrome) 是植物的紅光和遠紅光(600-750 nm)受體，以二聚體的形式存在，每個單體上共價結合一個線性的四吡咯環生色團(phytochromobilin，PΦB)。光敏色素有紅光吸收型(Pr)和遠紅光吸收型(Pfr)兩種構象形式，Pr吸收紅光後轉變為Pfr，Pfr吸收遠紅光後轉變為Pr。人們通常認為Pfr是光敏色素的活性形式。迄今為止已報道了許多光敏色素的互作蛋白，而這些互作蛋白與光敏色素的哪種形式相互作用，是人們感興趣的問題。

酵母雙雜交是最常用的檢測蛋白-蛋白相互作用的方法之一。商業化的酵母雙雜交系統均是將DNA結合結構域(DNA-BD)和啟用結構域(AD)置於待研究蛋白的N端，而光敏色素的N端必需自由，才能形成Pr或Pfr構象；此外，酵母細胞中不表達光敏色素的生色團。2002年，Peter Quail教授實驗室建立了基於GAL4的酵母雙雜交系統(原理見圖1A)，將GAL4 DNA-BD置於光敏色素的C端，並向培養基中新增提取自螺旋藻的生色團(phycocyanobilin，PCB)，然後給酵母細胞照射遠紅光或紅光，最終實現了光敏色素Pr/Pfr形式與其互作蛋白在酵母細胞中的光可逆互作。

近20年來該系統被廣泛應用於光敏色素領域的研究，對揭示光敏色素訊號轉導的分子機制發揮了重要作用。但是，也有一些光敏色素與其訊號分子的互作(如phyA與COP1及phyA與TZP)，在其他互作系統中得到了驗證，但是在該GAL4酵母雙雜交系統中檢測不到。

圖1. 用於檢測光敏色素與訊號分子光可逆互作的酵母雙雜交系統的原理(A)和LexA系統載體圖(B)

常用的酵母雙雜交系統大都基於GAL4或LexA，兩個系統各有特色。李繼剛課題組對商業化的LexA酵母雙雜交系統進行了改造，在pLexA載體的LexA DNA-BD編碼序列上游新增多克隆位點，使LexA DNA-BD置於光敏色素的C端(圖1B)。向培養基中新增PCB以及給酵母細胞照射遠紅光或紅光後，李繼剛課題組使用該系統驗證了幾組已知的光敏色素與訊號分子的光可逆互作，包括phyA與FHY1/FHL以及phyA/phyB與PIFs的互作，結果表明該系統具有很好的重複性和很高的靈敏度。此外，phyA與COP1以及phyA與TZP這兩組在GAL4系統中無法檢測到的互作，在該LexA系統中得到了很好的呈現：TZP與Pr和Pfr形式的phyA均互作，而COP1更傾向於與Pfr形式的phyA互作(圖2)。

先前的研究表明，光敏色素的Pr形式接收紅光後轉變為有活性的Pfr形式，而Pfr形式的光敏色素透過與SPA蛋白互作，破壞COP1/SPA蛋白複合體的形成，從而抑制COP1的E3泛素連線酶活性，使光形態建成的促進因子(如轉錄因子HY5)快速積累，最終促進植物的光形態建成。該LexA系統的結果表明，phyA Pfr可能透過與COP1和SPA蛋白均直接互作，最終破壞COP1/SPA蛋白複合體的形成、抑制COP1的活性，這為深入理解光敏色素的訊號轉導機制提供了新的線索。

圖2. phyA與COP1和TZP在LexA酵母雙雜交系統中均相互作用

中國農業大學生物學院博士研究生李洪為該論文的第一作者，博士研究生秦昕妍、宋鵬宇和韓潤參與了部分工作，李繼剛教授為該論文的通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金、北京高校高精尖學科建設專案等經費的支援。

論文連結：

https://link.springer.com/article/10.1007/s42994-021-00034-5