點評 | 魏文勝（北京大學），李大力（華東師範大學）
責編 | 兮
2020年，Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna兩位女科學家因在基因編輯技術CRISPR-Cas9領域做出傑出貢獻被授予諾貝爾化學獎（特別緻敬CRISPR幕後的英雄們——最全的一份CRISPR英雄譜），自此CRISPR成為了家喻戶曉的名詞。CRISPR最初發現於原核生物基因組上的一段重複序列，是細菌對抗外敵入侵的重要武器。在CRISPR-Cas9系統中，細菌利用Cas9核酸酶和可變短片段導向RNA複合物，識別特定外源DNA序列，然後消滅病原體。基於這一簡單、高效的系統，科學家開發出了可切割幾乎任何生物、任何DNA序列的分子剪刀，CRISPR-Cas9因其操作簡便、可編輯範圍廣等特點，已經成為基因編輯技術的代名詞。
近年來，基因治療、免疫治療和再生醫學等領域不斷取得重大突破。經CRISPR編輯後的人多潛能幹細胞iPSC，經過基因修飾、可靶向識別腫瘤的CAR-T細胞等具有重要臨床應用價值，但由於這些細胞基因編輯效率（特別是HDR或精準基因插入效率）有限，阻礙其在臨床上的廣泛使用。因此，探究細胞基因編輯後動力學修復機制，並有效提高HDR效率，是細胞治療應用於臨床需要解決的一個瓶頸問題。
近日，中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所）實驗血液學國家重點實驗室張孝兵/程濤/張磊教授團隊在Nucleic Acids Research雜誌發表題為“Dynamics and competition of CRISPR–Cas9 ribonucleoproteins and AAV donor-mediated NHEJ, MMEJ and HDR editing”的研究論文，首次揭示了CRISPR-Cas9核糖核蛋白聯合AAV供體進行基因編輯後NHEJ、MMEJ及HDR各編輯結果間動力學競爭關係。
2017年，該研究團隊在Genome Biology雜誌上發表論文指出，雙切模板載體可提高精準基因編輯效率5倍以上，受到學界普遍關注，論文已被引用200多次（谷歌學術）。但是這種細菌質粒載體不適用於原代細胞基因編輯，因為質粒進入細胞漿後會引起強烈先天免疫反應，可能導致細胞死亡。為此研究團隊在該研究中使用了腺相關病毒載體AAV6作為HDR編輯模板。AAV已經廣泛應用於臨床試驗，血清型6可以高效轉導進入造血幹細胞、T細胞和多能幹細胞等，然後指引細胞進行精準基因編輯。作者還使用了化學修飾的導向RNA，其體內穩定性比體外轉錄的導向RNA高很多，而免疫原性低很多，具有良好的臨床應用前景。因此文章報道的研究成果可以直接用於臨床轉化。
雖然CRISPR-Cas9被認為是基因編輯工具，但它本身只起到識別和切割DNA的作用，編輯過程是由幾十億年生物進化產生的，存在於所有細胞的精巧DNA修復機器完成。當DNA雙螺旋結構斷裂後，細胞會立即啟動DNA損傷修復機制，主要包括經典的非同源末端連線（c-NHEJ/NHEJ）、非傳統的末端連線或微同源介導的末端連線（alt-EJ/MMEJ）和同源模板指導的精確修復（HDR）等。DNA斷裂修復過程可能會破壞基因的開放閱讀框，造成等位基因敲除。在提供HDR模版的情況下，可實現基因的精確敲入。目前，HDR供體主要包括質粒、單鏈寡脫氧核糖核苷酸（ssODN）和AAV等。
圖1 使用RNP和AAV6 HDR供體模板進行精確HDR編輯的示意圖
圖2 Illumina測序分析後的視覺化編輯結果
作者在成人外周血重程式設計來源的iPS細胞、原代T細胞、人慢性髓性白血病細胞株K562細胞和單核白血病細胞株U937等四種細胞型別中，對超過80個位點進行基因編輯，然後在不同的時間點收集細胞，PCR擴增編輯位點臨近序列，進行高通量測序分析，獲得編輯模式的詳細圖譜（圖1）。經Illumina雙端150bp測序和系統性分析基因編輯結果表明（圖2），不同導向RNA（gRNA）、不同細胞型別間基因編輯效率和模式存在明顯差異。曾經人們認為，Cas9-gRNA介導的雙鏈DNA斷裂後，其修復結果是隨機的，不可預測。然而越來越多的研究表明，來源於化膿性鏈球菌的SpCas9容易造成不對稱切割，形成斷裂DNA的5’端垂懸結構，這就導致了非隨機修復，產生可以預測的DNA編輯結果。利用慢病毒文庫所得的大量CRISPR-Cas9編輯資料，一些研究團隊透過訓練機器學習模型，開發出根據gRNA序列資訊進行預測編輯結果的工具，例如inDelphi、FORECasT等。作者將大量核糖核蛋白RNP電轉得到的真實編輯結果與上述預測軟體的預測結果進行比較，發現這些預測軟體雖有一定參考價值，但是對於臨床治療意義重大的iPS細胞、T細胞的預測結果仍然存在較大偏差（圖3）。
以前的報道以及作者的RNP編輯資料都表明， NHEJ+1（特別是A/T插入）在所有編輯結果中佔據明顯的優勢地位，作者假設這種現象可能與不同DNA修復途徑的動力學相關聯。將RNP電轉後5個連續時間點的各個代表性DNA修復情況的頻率繪製成圖，取效率達到最大值的一半（50%）時的時間數值作為該編輯情況的T50，統計分析得出在四種細胞中各個代表性修復途徑的發生速度。在iPS細胞中，NHEJ+T、+A、+C、+G的平均T50分別是6.2、7.8、7.9、6.6小時，MMEJ介導的-3～-5、-6～-9、-10～-23（3-23個鹼基刪除）的平均T50分別為18.4、19.9、23.9小時（圖4），HDR的發生速度介於NHEJ和MMEJ兩者之間。以上結果表明，CRISPR-Cas9基因編輯後，NHEJ的發生速度最快，接下來是HDR，而MMEJ修復最慢，這就可以解釋為什麼經常發現高比例A/T（腺苷酸或胸腺嘧啶）插入的現象。這一發現對gRNA的設計和挑選帶來一些啟示：例如希望在敏感的原代細胞中敲除某些基因，可以儘量選擇PAM前-4位鹼基（或者預期切割位點前一位）是A或T的gRNA，在保證移碼突變效率的同時，細胞在5-10個小時內就可以利用NHEJ修復途徑快速修復斷裂的雙鏈DNA，減少雙鏈DNA斷裂引起的細胞毒性；反之，若想提高精確的HDR基因敲入，需要儘量避免使用這種具有明顯傾向性的gRNA。
圖3. iPS細胞、T細胞和K562 RNP編輯結果與軟體預測結果比較
圖4 Cas9–gRNA RNP介導的dsDNA切割後NHEJ或MMEJ修復的動力學
由於NHEJ是修復DNA斷裂損傷最主要且快速的修復途徑，一定程度上阻礙了HDR的發生，因此作者期望尋找有效的NHEJ抑制劑提高HDR的效率。經過對14種小分子藥物及其不同組合的測試，首次報道兩種小分子M3814（NHEJ抑制劑）和Trichostatin A（TSA，HDAC抑制劑，可以鬆散染色質結構）的組合能夠有效抑制NHEJ，從而在一定程度上避免了優勢修復途徑NHEJ，提高了期望的HDR編輯結果。M3814+TSA這種小分子化合物組合適用於多種細胞（在人iPSC和T細胞中提高HDR效率2～4倍，圖3）以及多種模板載體（質粒載體及AAV載體）。
圖3 M3814和TSA小分子組合增強iPSC和T細胞mNeonGreen報告基因的HDR插入效率
總之，該研究首次揭示了CRISPR RNP-AAV系統基因編輯後NHEJ、MMEJ及HDR各編輯結果間動力學競爭關係，利用M3814+TSA小分子組合抑制NHEJ +A/T將成為多種細胞型別中提高HDR效率的通用策略，從而實現CRISPR基因編輯技術的普遍應用。
經過基因敲除編輯的T細胞已經進入臨床試驗，取得了積極的療效，同時證明了基因編輯細胞治療的安全性。未來幾年，同時經過基因敲除和敲入編輯的T細胞將逐漸進入臨床。
中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所）實驗血液學國家重點實驗室張孝兵教授、程濤教授和血栓止血中心張磊教授是本文的共同通訊作者。中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所）博士生傅雅文、代新嶽和助理研究員王文天為本文的共同第一作者。
專家點評
魏文勝 教授（北京大學生命科學學院，北京大學生物醫學前沿創新中心）
作者報道了在與臨床應用密切相關的T細胞、iPSC和常用細胞系（U937和K562）中，DNA雙鏈斷裂後隨時間推移DNA損傷修復的動力學變化。透過對超過80個打靶位點的深度測序發現每個切割位置存在著佔主導的修復方式，並展示了在提供HDR模板後能夠改變這一偏好。作者發現常見的+1 nt（A/T）NHEJ修復結果由於發生較快佔據主導地位，對HDR具有抑制作用。針對不同DNA損傷修復過程抑制劑的作用，作者發現M3814+TSA組合可以改變DNA損傷修復的平衡（抑制NHEJ +A/T的發生），有利於大幅度提高HDR效率。該研究系統展示了CRISPR RNP-AAV系統基因編輯後NHEJ、MMEJ及HDR各編輯結果間動力學競爭規律，新的化學抑制劑組合能夠有效抑制NHEJ以提高HDR的修復效率，具有重要的應用價值。
專家點評
李大力 教授（華東師範大學生命科學學院）
Cas9編輯DNA之後的產物序列規律是基因編輯領域的熱點問題，之前的研究多集中在非同源重組修復中基因編輯產物的序列特性，而對於在有重組模板的情況下的編輯產物特性鮮有報導。作者從這一重要的視角出發，透過臨床上非常成功的AAV匯入重組模板，較為系統地在4種細胞系中比較了6個基因座通重組模板對於修復產物的影響。該研究動態地顯示出DNA雙鏈斷裂後，NHEJ介導的小片段插入缺失（特別是+A/T）發生速度快於MMEJ介導的長片段（>2 bp）刪除和HDR而且重組模板存在的情況下HDR與NHEJ、MMEJ的發生存在競爭關係，例如MMEJ介導的長片段缺失會顯著減少最後，作者透過篩選已知能干擾NHEJ的14種小分子化合物，發現聯合使用DNA-PK抑制劑M3814和組蛋白脫乙醯基酶抑制劑TSA，可以顯著提高AAV6供體模版介導的HDR效率。
總之，作者首次揭示了CRISPR RNP-AAV系統基因編輯後NHEJ、MMEJ及HDR各編輯結果間動力學競爭關係，並透過抑制NHEJ +A/T的發生有效地提高了iPSC和T細胞等多種細胞HDR效率，該研究為細胞介導的基因治療提供了新的思路，希望將來能將此技術應用到基因編輯細胞治療的臨床研究之中。
原文連結：
https://academic.oup.com/nar/article/49/2/969/6062765
製版人：琪醬