近年來，在人類多能幹細胞(HPSCs)分化的可靠程式的開發方面取得了相當大的進展。朝著這個方向邁出的重要一步也是類器官的衍生。這項技術通常依賴於傳統的三維培養技術，這些技術利用hPSC的細胞自主自組織反應，對提供給系統的外部輸入進行最小限度的控制。

幹細胞生物學和生物工程的融合提供了以可控的方式提供這些刺激的可能性，導致了自然激發的方法的發展，以克服這項新興技術的主要限制。基於目前的發展，我們強調了將hPSC器官分化、生物工程和倫理學結合在一起的成就和持續的挑戰。

這篇綜述強調了需要提供工程解決方案，以獲得對hPSC衍生器官的自組織和功能的控制。我們期望這些知識將指導社群產生更高級別的hPSC衍生器官，以進一步應用於發育生物學、藥物篩選、疾病建模和個性化醫學。

在過去的二十年裡，幹細胞研究透過利用成體幹細胞(ASCs)和多能幹細胞(PSCs)的自組織特性，促進了我們對器官發生的關鍵方面的理解。這些進展導致了細胞培養程式的發展，以根據需要產生微型和微器官樣的結構，即所謂的類器官。與此同時，生物工程領域的出現導致了技術進步，允許適當的指導性環境(物理和化學)，增強細胞對在這些微型器官樣結構中形成器官特異性多細胞結構的反應。

目前的方法依賴於傳統的三維(3D)培養技術，該技術利用了人類PSCs的細胞自主自組織(HPSCs)(圖1)。儘管如此，hPSC衍生的類器官仍然存在一些不足之處。這些問題包括缺乏重複性；在細胞型別組成方面缺乏特異性：大小失控，形狀異質性：缺乏適當的血管、免疫和神經成分以及器官特有的形態特徵以及缺乏功能性。因此，器官技術目前的主要目標是提高類器官的細胞和形態的複雜性(例如，透過誘導腦器官中組織合理的區域特性，或在腎臟器官中提供一個發展中的分支收集管道系統)，提供可灌流的血管網路(促進器官的分化和壽命，但也促進器官到器官的連線，以研究不同組織型別之間的複雜相互作用)，以及促進類器官的成熟，以實現相關的組織特異性功能。

圖1|hPSC衍生器官工程研究進展

在這篇綜述中，作者團隊首先回顧了類器官技術的歷史淵源，以及3D細胞培養系統的早期發展是如何利用hPSC的自組織能力來產生這些強大的平臺的。將共同研究如何應用類器官力學和轉錄學的最新知識來進一步控制hPSC衍生的類器官的排列、功能和組成。然後，其預見了工程方法(即仿生水凝膠、3D生物列印和微技術)在未來幾年克服目前hPSC衍生有機物挑戰的直接影響。最後，討論倫理學家、工程師和幹細胞生物學家如何在工程倫理方面進行合作，以及這種共同努力將如何有利於整個hpsc衍生器官領域的成功。

器官曆史中三維培養的演變。自20世紀以來，發育生物學家選擇了不同的模式生物來研究組織和器官發育過程中的形態發生過程，包括海綿、兩棲動物、雛鳥和小鼠。所有這些不同的系統都為解決該領域長期存在的關鍵問題做出了重大貢獻。上個世紀頭幾十年在這些生物體中進行的開創性觀察突出了組織遵循預定發育和功能程式的內在能力，以及這些能力如何決定了細胞在重新聚集過程中的相互和排他關係。

隨著3D培養知識的進步，人們致力於探索細胞外基質(ECM)如何在廣泛的細胞培養中決定形態發生和功能。後來，Hans Clevers及其同事應用這一知識，在特定培養條件下培養了嵌入Matrigel中的Lgr5+小鼠腸道幹細胞的單細胞懸浮液，成功地生成了具有隱窩絨毛結構的腸道器官。這項開創性的研究和其他研究促進了ASC衍生器官的發展，如胃、胰腺、結腸、前列腺和肝臟。

提高複雜性的生物工程策略。HPSc類器官的產生主要依賴於自組織原理，對提供給系統的外部輸入的控制最小。同時，這些過程的不可控性質導致了目前觀察到的器官系統的高度異質性，這導致不同實驗室之間hPSC分化的重複性較低，不同hPSC系之間分化結果的差異性，以及實驗間的差異。由兩種化學物質呈現的工程控制的微環境、物理指令代表了實現這些線索可程式設計性的合理途徑，以便更好地控制器官的自組織和分化。

工程自組織。在眾多的發育過程中，相關的形態來源和物理線索的梯度不斷地幫助建立在活體中出現的結構的極性和多樣性。以同樣的方式，在自組織類器官系統中，連續的區域性微環境改變迅速促進複雜細胞模式的出現，進一步推動體外類器官的形態發生。然而，控制自組織器官中的這些形態發生過程只能透過在系統外部施加生化和生物物理邊界來實現。因此，控制初始細胞密度、細胞聚集體的幾何形狀和大小、細胞-ECM相互作用和生化梯度的工程方法將為hPSC衍生器官的產生提供更準確的指導。相反，當目標是改變發展道路以實現不同的結果時，也可以利用這些戰略。

微圖案化技術已被用於透過在培養基質中建立具有限定幾何形狀和大小的受限2D圖案來控制物理邊界條件。使用這種2D方法，在BMP4存在的情況下，hPSCs在有限的圓形模式下培養，產生來自不同胚層的同心模式的細胞，即所謂的人類胃泌素。類似地，心臟微組織也可以透過以圓形模式種植hPSCs來重複誘導。這些研究表明，生物化學線索和生物物理細胞限制之間的協同作用，對於引導細胞命運反應，緊密依賴於圖案几何形狀和大小(圖2A)。

圖2|引導hPSC衍生器官自組織的工程方法

在體內，細胞外基質動力學可以勾畫出引導組織形態發生的組織邊界。例如，細胞外基質重塑已被證明在分支形態發生過程中發揮重要作用，這是一個關鍵的發育過程，決定著肺、腎(輸尿管芽)、乳腺和唾液腺(頜下腺)等器官的功能結構。雖然ECM的機械特性決定了細胞的行為，如增殖和分化，但只有少數研究探索了使用模擬體內ECM的合成材料來指導hPSC衍生的器官的形成(圖2B，C)。值得注意的是，雖然大多數天然ECM是非線性和粘彈性的，但許多合成矩陣不是。這些特徵及其對器官自組織的影響仍在研究中。

轉錄學和組織力學。類器官技術與新興的轉錄學和組織力學技術的融合為研究人類發育和組織形態發生提供了前所未有的機遇，併為個性化和精確的醫學應用提供了新的前景。到目前為止，大多數類器官(和器官)在分化過程中都被批次繪製了輪廓或進行了測序，但該領域正在迅速向更深入地瞭解類器官(和器官)的細胞組成前進。此外，器官特定資料集的可用性增加，再加上機器學習演算法(即人工智慧)的使用，使得預測精度成為可能在細胞器中存在的細胞型別的統一性評分。

這種演算法的一個例子是KeyGenes，它已經被用來預測腎臟器官類物質與人類胚胎腎臟的接近程度，顯示出隨著時間的推移向中期妊娠腎臟的分化程序。體內每個發育轉變所需的分子訊號通路和組織特異性轉錄因子的動態正在被揭示。與此同時，還在開發其他技術，以便在全基因組資訊的基礎上整合位置資訊，如原位測序和高多重成像質譜。這些新技術將有助於將位置資訊與細胞內的細胞特徵和狀態聯絡起來。當在器官形成過程中的不同時間點使用這些程式時，這些程式有可能為器官內的每個細胞定義一個生化特徵。此外，在器官個體發育過程中評估環境或遺傳操作前的差異反應對於捕捉疾病表型也是重要的(圖3)。

圖3|整合新興技術以瞭解組織形態發生

在體內，遺傳程式和多種微環境線索的複雜組合指導著發育過程中組織和器官的形成。這些相互作用控制著一系列機械過程，如變形、重塑和流動，最終形成器官。目前對形態發生機制的理解在很大程度上是透過自上而下的方法獲得的，由此導致形狀變化的機制可以被解構。雖然這些方法的相關性是顯而易見的，但就成像和機械力化學操作而言，使用胚胎的缺點是可獲得性有限。

相反，hPSC衍生器官代表了一種負擔得起的體外模型，用於評估人類組織形態發生的力學方面以及這些過程在疾病期間的影響。在開發探測器官力學的工具的同時，支援力學測量以預測和指導形態發生的計算工具和模型的進步是至關重要的。到目前為止，已經開發了不同的模型系統來解釋扁平上皮單分子層的動力學，包括晶格模型、相場模型、活性網路模型、粒子模型和連續介質模型。它們在三維方面的應用已經取得了一些成功。事實上，就在最近，卡爾茲布倫和他的同事們探索了一種類似的方法來模擬人類大腦器官體外發育和自組織過程中皺紋外觀的摺疊物理過程(圖3)。

總體而言，器官內細胞的轉錄資訊和機械訊號在時間和空間上的耦合將為研究人類發育和疾病過程中有機物質的動力學和組織功能的出現以及對不同環境刺激或遺傳操作的響應提供精確的描述。

提高成熟度和功能的生物工程策略。目前的類器官方法已經允許形成壽命和功能有限的相對複雜的組織狀結構。重要的是，使用患者特定的IPSCs 或透過CRISPR/Cas9介導的基因編輯在方正hPSCs 中或在器官分化的時間過程中耦合這些方法的可能性已經開始顯示這些系統在疾病建模應用中的實用性。這些系統的最終實現推動了工程方法的發展，以提供必要的營養和氣體交換需求，以允許增加尺寸、壽命、複雜性和成熟度。雖然這些策略可以提供從有機物生成更大規模組織的可能性，但它也可以允許不同型別的組織連線，例如透過嵌入血管系統。

在大多數有機培養系統中，養分和氣體交換是透過培養被動擴散來實現的。為了解決營養和氣體供應不足的問題，一些研究在連續攪拌下或旋轉生物反應器中培養類器官。在設想器官血管化策略時，一個重要的問題是如何產生器官特異性內皮細胞，這些細胞能夠正確地組織和組裝，形成支援器官功能的器官特異性血管。

在免疫缺陷小鼠體內，hPSC來源的腦器官、肝芽或腎器官的體內血管化(宿主來源的血管化)已經部分實現。在一種不同的方法中，hPSC衍生的腎臟器官被植入到雞的CAM上，顯示宿主血管化，但也形成了毛細血管環狀腎小球樣結構，人類來源的內皮細胞與足細胞樣細胞密切接觸(圖4A)。總之，這些發現表明，移植後功能性血管網路的形成可能需要微環境的協同調節，以及宿主血管系統和植入的hPSC衍生器官中存在的內皮承諾細胞(PRE)之間形成適當的相互作用。這最後一點可能會被證明在內胚層和外胚層hPSC衍生的器官中既是必要的，也是具有高度挑戰性的，因為在分化開始時，內源性的替代間充質命運(即內皮細胞)的形成很少或完全缺失。

圖4|hPSC衍生的器官血管化工程策略。

使用微流控系統來設計血管化是體內移植方法的另一種選擇。在體外，微血管是透過將內皮細胞包裹在水凝膠中形成的，水凝膠被引入微流控裝置，自組裝成可灌流的血管網路。這一方法已經被進一步探索，以建立血腦屏障(圖4B)、腫瘤血管生成和腫瘤細胞外滲的模型。

在發育過程中，器官的形狀受到來自鄰近發育組織的生化和生物物理訊號的調節。這些複雜的組織-組織相互作用可以在體外透過器官的空間預構圖和各種3D共培養方法來模擬。西村龍一(Ryuichi Nishinakamura)團隊開創了小鼠PSC來源的輸尿管芽祖細胞和腎單位祖細胞的代代，這些細胞與分離的小鼠基質細胞進一步手工組裝在一起，產生模仿胚胎腎臟器官型結構的腎臟器官。

將來，在基質細胞存在的情況下，透過3D生物列印將天然的或PSC來源的分支上皮整合到發育中的腎臟器官中，可能是一種經濟合理的方法來精確定位這些不同的成分，這樣分支上皮就可以在腎臟器官分化過程中作為組織幾何的組織者。在類似的方法中，使用以不同的致力於細胞的祖細胞為起點，Takebe及其同事實現了肝芽的衍生。其他可能受益於3D生物列印應用的有機系統是那些需要來自不同胚胎譜系的細胞相互作用的系統。最近的一個例子是具有功能性腸道神經系統的腸道組織的產生(圖5)。

圖5|設計組織-組織相互作用的方法。

在另一項研究中，Birey和他的同事透過體外3D組裝來自hPSC的預分化的背側和腹側前腦球體來模擬大腦區域間的相互作用，這些球體被稱為“腦集合體”，事實證明，這重現了在胎兒前腦中觀察到的中間神經元的跳躍式遷移。重要的是，當一種名為Timothy綜合徵的神經發育障礙被用這種裝配系統建模時，這種功能特徵是不正常的。遵循類似的方法，Takebe和他的同事在vitro中重述了人類肝-膽-胰組織邊界(圖5)。

總體而言，這些方法需要進一步最佳化，以實現適當的細胞到器官和器官到器官的整合，並有能力將體內發育和生長概括為更復雜和更有功能的組織結構。

儘管類器官工程領域取得了快速的進展，但由於缺乏實驗和概念上的有器官力學途徑，面臨著長期的挑戰。再加上具有良好可調和可控生物物理特性的設計基質的開發，所有這些進展對於提供適當的生理訊號來驅動幹細胞自組織和構圖而不限制後來的形態發生是必不可少的。

另一方面，轉錄學的應用將揭示器官中產生的細胞型別的複雜性，特定細胞群體相對於其他細胞群體的比例，以及它們的分化狀態和空間分佈。所有這些資訊最終將有助於提高當前hPSC-器官分化過程的有效性、重複性和穩健性。

此外，確定適當的放大原則以保持生理引數的絕對值和器官內不同型別細胞之間適當的相對比例，可能有助於更好地模擬體內的生理條件。在穩態和類疾病條件下詢問類器官生物功能時，加強對多種組織-組織相互作用的控制，最終將支援hPSC-器官技術在個性化和精確化醫學中的新時代應用。