通訊單位：中國科學院天津工業生物技術研究所，中國科學院深圳先進技術研究院

文章DOI：10.1002/anie.202017225

關鍵詞：生物催化，β-氨基酸脫氫酶，催化機理，蛋白質工程，不對稱合成

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氨基酸脫氫酶（AADHs）催化可逆的氨基酸氧化脫氨和酮酸的還原胺化反應，由於其原子經濟性，在手性氨基酸的不對稱合成中具有巨大的應用潛力。然而，與廣泛研究的α-AADHs相比，關於使用β-AADHs合成β-氨基酸的報道還很少。近期，科研人員對β-AADHs的晶體結構、催化機理、理性設計及合成應用展開了系統性研究。研究發現，β-AADHs家族中唯一已知成員l-赤式-3,5-二氨基己酸脫氫酶（3,5-DAHDH）的晶體結構與α-AADHs相比有很大的不同。藉助於量子化學計算和定點突變實驗，研究人員揭示了該酶在底物識別、催化機制方面與α-AADHs的差異。隨後，透過晶體結構與催化機理指導的蛋白質理性設計，在不犧牲對映選擇性的前提下，擴大了底物作用範圍，獲得了對多種脂肪族β-氨基酸活性提高110-800倍的突變體酶。最後，利用這些優異突變體不對稱還原胺化β-酮酸高效製備了兩種手性β-氨基酸（> 99% ee），分離產率為86%-87%。這些結果不僅揭示了3,5-DAHDH底物特異性的分子機理，也開闢了一條綠色的不對稱合成高價值β-氨基酸的新途徑。

背景介紹

手性β-氨基酸不僅是多種天然化合物中的重要組成部分，也是許多合成藥物和多肽的關鍵結構單元，具有重要的應用價值，開發高效、綠色的合成方法已是當前的研究熱點。生物催化具有反應條件溫和、立體選擇性高、綠色環保等多種優勢。其中，β-酮酸或β-羥基羧酸及其衍生物的胺化反應是一種直接獲得β-氨基酸及其衍生物的方法。例如，轉氨酶可以利用有機胺供體催化β-酮酸合成光學活性的β-氨基酸，但在實際應用中，其催化效率和應用範圍還有待進一步提高。鑑於α-AADHs可以催化α-酮酸不對稱合成手性α-氨基酸，可以推測β-AADHs同樣可以催化β-酮酸的不對稱還原胺化獲得手性β-氨基酸。在α-AADHs催化反應中，透過與甲酸脫氫酶偶聯，不僅可以實現輔酶迴圈，而且其反應物甲酸銨還可以作為還原胺化反應的氨供體，具有較高的原子經濟性。來自α-AADHs家族的亮氨酸脫氫酶用於l-叔亮氨酸的生產就是工業化應用的典範。

然而，目前已報道的β-AADHs只有賴氨酸降解途徑中的l-赤式-3,5-二氨基己酸脫氫酶（3,5-DAHDH），且這類酶一般只對天然底物(3S,5S)-DAH具有較高活性，嚴重限制了其合成應用範圍。在前期研究工作中，我們採用結構域逐點掃描策略對來源於Candidatus Cloacamonas acidaminovorans的3,5-DAHDHcca進行了改造及篩選，並且獲得了底物譜較廣的突變體（ACS Catal. 2015, 5, 2220-2224.）。然而，這些突變體的活力依然非常低。由於該酶的晶體結構未得到解析，也沒有同源性較高的已知結構，突變位點如何影響底物譜及酶催化活性的分子機制也就無從得知。另外，如何在保持良好立體選擇性的同時，擴大底物譜、提高酶的催化活性，省時、省力、高效地對酶分子進行改造，瞭解其底物識別和催化機理是非常必要的。

圖文解讀

1. 3,5-DAHDHcca的晶體結構

本研究獲得了3,5-DAHDHcca的空晶結構、與NADPH的複合物結構及突變體E310G/A314Y•NADPH複合物結構。其單體結構由輔酶結合域和催化結構域組成，NADPH位於二者之間深的裂縫中，這與α-AADHs結構是類似的。不同的是，3,5-DAHDHcca的完整催化功能單元是同源二聚體，且活性中心恰好位於兩個亞基聚合的區域（結合在A亞基上的NADPH的醯胺基團與C亞基上的E310位點形成氫鍵相互作用）；而已報道的α-AADHs、天然氨脫氫酶（AmDHs）均是單亞基即可完成催化反應。

圖1. 3,5-DAHDHcca的晶體結構。

透過比較WT•NADPH和E310G/A314Y•NADPH結構發現，該酶的催化結構域具有很大的柔性。由於酶在反應過程中是動態的、變構的，且一般認為脫氫酶在結合底物後，輔酶結合域和催化結構域會形成“閉合”構象，以促進反應的進行。E310G/A314Y•NADPH是處於“閉合”構象的結構，即更加接近反應時的狀態。圖2c是處於“閉合”構象時NADPH的C4原子指示出的底物口袋。

圖2. WT•NADPH與E310G/A314Y•NADPH結構間的比較，以及NADPH的C4原子指示的底物口袋。

2. 3,5-DAHDHcca的催化機理

透過量子化學計算和突變研究，進一步確證了3,5-DAHDHcca關鍵的底物識別位點和催化位點。理論計算推出的催化機理顯示，3,5-DAHDHcca催化的氧化脫氨反應主要包括氫負離子轉移形成亞胺中間體、水合中間體的形成以及C-N鍵斷裂等步驟，這與α-AADHs的催化機理相似。目前對α-AADHs反應機理的研究有限，限速步驟還不是很清楚，但有研究表明在苯丙氨酸脫氫酶催化的反應中氫負離子轉移不是氧化脫氨反應的限速步驟。而本研究中，基於量子化學計算得出的反應能壘明確指出，氫負離子轉移和C-N斷裂是3,5-DAHDHcca催化反應的限速步驟。本研究還發現，除了D177外，天然底物(3S,5S)-DAH的未質子化C5氨基同樣可以在水合步驟中作為質子受體起到活化水分子的作用。與之相比，在α-AADHs或AmDHs中，目前研究表明僅氨基酸殘基可作為反應的催化基團。這揭示了3,5-DAHDH底物特異性的分子基礎，且為後期擴充套件該酶底物譜的分子改造工作提供了有力的指導。

圖3. 3,5-DAHDHcca的催化機理

3. 3,5-DAHDHcca的分子改造與合成應用

在前期的研究工作中，已獲得的突變體E310G雖然拓寬了3,5-DAHDHcca的底物譜（ACS Catal. 2015, 5, 2220-2224），但由於破壞了E310與輔酶間的相互作用，導致醯胺基團不穩定進而影響酶的催化活性。在本研究中，以(R)-β-高甲硫氨酸為模式底物，根據蛋白結構和理論計算資訊對酶進行理性設計，透過重建輔酶醯胺基團與附近殘基的氫鍵相互作用，成功獲得了催化活性提高的突變體。進一步透過分子改造重塑底物口袋，提高酶與底物間的親和力，最終獲得了對(R)-β-高甲硫氨酸活力提高約200倍的突變體，這相當於野生型酶活力的1.8×104倍。底物譜測試結果表明該突變體對脂肪族底物(S)-3-氨基己酸和(S)-β-高賴氨酸也有較好的催化活性。最終，透過Novozym435水解β-酮酸酯底物獲得β-酮酸，進而利用優異突變體還原胺化β-酮酸，實現了手性β-氨基酸的高效不對稱合成。其中，轉化154 mM底物生成(R)-β-高甲硫氨酸和(S)-3-氨基己酸的產率分別為93%和95%，ee > 99%，分離收率可達86-87%。

圖4. 針對底物(R)-β-高甲硫氨酸的分子改造及突變體的相對活性

結論與展望

透過X-射線晶體學研究、量子化學計算及定點突變研究，不僅擴充套件了我們對β-AADHs唯一已知成員3,5-DAHDH底物結合和催化機制的理解，同時也表明了基於晶體結構和反應機理資訊的理性設計策略在改造β-氨基酸脫氫酶以擴充套件其底物譜的潛力，為進一步合理設計新酶實現目標β-氨基酸的不對稱合成奠定了堅實的基礎，從而開闢了一條綠色合成β-氨基酸及其衍生物的新途徑。

Liu N, Wu L, Feng J, et al. Crystal Structures and Catalytic Mechanism of l‐erythro‐3, 5‐Diaminohexanoate Dehydrogenase and Rational Engineering for Asymmetric Synthesis of β‐Amino Acids[J]. Angewandte Chemie. DOI: 10.1002/anie.202017225