雙光子技術和基因編碼的鈣指示劑已經成為測量大腦中神經活動高解析度成像的常規工具。

越來越多的證據表明，大腦複雜的功能是基於其高度平行計算的能力，想要理解感覺輸入和行為學輸出的神經聯絡可能需要全腦尺度的神經叢集活動分析。人腦中的神經元總數約為1000億個，能同時記錄儘可能多的神經元活動無疑會大大推進神經元網路的解析工作。

最近，美國洛克菲勒大學的Vaziri實驗室發展了光珠顯微鏡（Light Beads Microscopy，LBM）技術，大幅度增加了可以實時成像的細胞數量。LBM可以實現每秒 1.41×10^8體素速度的體積記錄，同時記錄高達100萬個神經元。研究結果上傳到預印本網站：bioRxiv

Vaziri實驗室使用 LBM，對小鼠皮層進行了多個尺度的介觀和體積成像。其中包含在大約5Hz 處> 200,000個神經元，在約2Hz 處的約100 萬個神經元，它還可以實現更高速度（9.6 Hz）的亞細胞解析度的體積記錄。

背景和原理

在有限的共振掃描速度制約下，高鐳射器重複頻率會導致不可避免的過度取樣以及每畫素多脈衝可以在低脈衝能量下的信噪比（SNR），而每畫素單脈衝可以使遞送到大腦的單位功率產生的信噪比最大化，以應用程式規定的最小橫向密度進行取樣可釋放時間資源。

這些方法的問題在於其適合稀疏標記的樣本，而非大型神經網路成像。透過掃描在時間上延遲並指向樣品單獨區域的單個鐳射脈衝的N個副本，可以使用時間多路複用來提高資訊吞吐量。這種方法的限制在於資料速率增加了N倍，超出了掃描系統的慣性極限。

Vaziri 實驗室試圖透過LBM解決這些問題。LBM是一種可擴充套件且時空最佳的採集方法，並且僅受熒光壽命的限制。它可以同時適應介觀成像和雙光子。

在LBM中，顯微鏡掃描一組軸向分離且時間上不同的焦點（即“beads”），而不是單個焦點。beads 在單個畫素的保留時間記錄了樣品整個深度範圍中的資訊，因此 LBM在掃描單個平面所需時間內捕獲了整個體積。此外，透過取樣最佳化的空間取樣，LBM 可以將體積 FOV 擴充套件到介觀尺度，同時保留與GCaMP相容的體積率。

這裡的 light beads是透過一種基於腔的多路複用方法形成的，該方法稱為多軸向多路複用模組（Many-fold Axial Multiplexing Module，MAxiMuM）。

該模組能夠生成必要的多路複用光束列。鐳射聚焦在MAxiMuM腔體的入口處，並透過一系列凹面鏡進行重新成像。再成像鏡的標稱焦點與腔體的輸入之間存在偏移Δz，當光束返回到入口時，焦點會軸向偏移。由於焦點偏移，每個離開腔體的光束聚焦到樣品中較淺的深度，光功率相對降低。

MAxiMuM可以將N縮小到由GCaMP熒光壽命和鐳射器重複頻率限制的極限，並控制每個光束的相對功率和位置。因此它可以提供了30倍的軸向多路複用和141 MHz的體素採集速率，以及16μm的平面-平面軸向間隔。

Light bead microscopy schematics

應用展示

Vaziri 實驗室在中視鏡上實現了LBM的設計，並在亞細胞解析度上記錄約6×6 mm2的側向視場（FOV），並以約為5 Hz速度掃描了 GCaMP6s標記小鼠的新皮層中3×5×0.5 mm3大小的區域。

Volumetric recording of 807,748 neurons within ∼5.4 × 6 × 0.5 mm3 volume at 2.2 Hz in a GCaMP6s-expressing mouse

同時，LBM保持了在橫向體素取樣，FOV和成像速度之間進行權衡的能力，以適應不同的需求。Vaziri 實驗室記錄了各種配置從中等大小的FOV（600×600×500μm3）（具有解析亞細胞特徵的體素解析度），到大的FOV（5.4×6×0.5 mm3）（涵蓋了小鼠皮層的兩個半球，並捕獲了超過800,000神經元的神經元叢集動態），證明了LBM的多功能性。

Multi-scale functional imaging with light beads microscopy

透過這些LBM成像實驗，研究人員還發現，神經元的相關活動具有遠大於1 mm的特徵長度，進一步強調了介觀尺度上分析神經元活動的意義。

校審：Simon（brainnews編輯部）