導讀:
越來越多的證據表明線粒體在精神疾病中至關重要的作用。然而，對在調節焦慮和抑鬱神經迴路中調控線粒體的分子以及它們如何影響神經元的結構和功能，我們知之甚少。近期在《Biological Psychiatry》（IF 12.095）期刊發表了題為“Mitofusin-2 in the Nucleus Accumbens Regulates Anxiety and Depression-like Behaviors Through Mitochondrial and Neuronal Actions”的研究論文，作者發現在腦內伏隔核中過表達MFN2可透過對線粒體和中刺狀神經元結構和功能的作用對焦慮和抑鬱樣行為起調節作用，MFN2被認為是治療焦慮和相關行為障礙的有前途的治療靶點。
1. 高特質焦慮大鼠在抑鬱症測試中表現出努力動機減弱
根據雄性大鼠在高架迷宮(EPM)開臂的停留時間進行分組(圖1A)，分為高焦慮組(HA，≤5%開臂停留時間)或低焦慮組(LA，≥20%開臂停留時間)。每群大鼠約有8%的高焦慮大鼠和約20%的低焦慮大鼠。在新物體識別(NO)測試中，兩組焦慮小鼠的探索行為也有所不同，HA大鼠嗅聞新物體的潛伏期更高，在中心停留的時間更少，並表現出更多欲接近新異物體的行為(圖1B)。然而，在這些測試中大鼠總體活動距離沒差異。(EPM:補充圖1A; NO:補充圖1B)。
進一步對這兩個測試的行為資料進行了Z評分(見補充資訊)，證實了HA和LA大鼠在不同測試中焦慮樣行為的一致性(圖1C)。在糖水偏好實驗中，HA大鼠表現出比LA大鼠更低的糖水偏好(圖1D)。在強迫游泳測試中，HA大鼠不動時間更長 (圖1E)，這表明HA大鼠在逆境下被動應對反應增加，努力動機降低。這些結果表明，當在遠交Wistar大鼠中觀察到特質焦慮時，HA大鼠會表現出與抑鬱有關的動機缺陷。
表1. 不同特質焦慮的大鼠中觀察到不同的行為和累積神經元表型
2. 在高特質焦慮大鼠伏隔核的中型棘突神經元中發現樹突的複雜性和連線性降低
為了探索特質焦慮的差異是否與伏隔核的MSN的結構和功能的差異相關，對HA和LA大鼠的快速腦片伏隔核MSN進行了全細胞微小興奮性突觸後電流記錄。HA大鼠MSN表現出較低的興奮性輸入(圖1F，中間圖)。微小興奮性突觸後電流的峰值幅度沒有差異(圖1F，右圖)，提示HA和LA大鼠之間存在類似的突觸後反應。與電生理資料一致，從電生理記錄中獲得的充滿生物素的MSN的共聚焦分析顯示，與LA大鼠相比，HA大鼠MSN樹突分支較少（圖1G），總樹突長度較短（圖1H）棘突密度較低(圖1L)。樹突棘直徑隨神經元成熟而增大，並能反映突觸強度。為了研究焦慮與樹突棘成熟的關係，我們根據棘突頭端的最大直徑將樹突棘分為兩類(細長型棘突0.45um)。
與LA大鼠相比，HA大鼠細長型棘突更多且蘑菇型棘突更少(圖1L)。高爾基法染色進一步證實了HA大鼠MSN的樹突萎縮(圖1J)，包括比LA大鼠更短的樹突長度(圖1K)和更低棘突密度(圖1L)。此外，HA組細長型棘突的相對丰度高於LA組，而蘑菇型棘突的相對丰度低於LA組(圖1L，右圖)。為研究此結構差異在大腦中是否普遍存在，進一步測量了兩組大鼠基底外側杏仁核的樹突，發現兩組大鼠樹突結構和總樹突長度並無明顯差異(圖S1C，D)。綜上所述，HA大鼠樹突分枝和棘突密度的減少，以及伏隔核MSN的興奮性輸入減少。
3.高特質焦慮大鼠伏隔核內線粒體-內質網接觸減少
線粒體與樹突成熟以及突觸的形成和維持有關。先前研究證實HA大鼠伏隔核中線粒體功能受損(即呼吸減少，電子轉移鏈I和II的蛋白含量減少，ATP[三磷酸腺苷]減少)。伏隔核中線粒體區域性功能障礙降低了社會競爭力，而社會競爭力的降低是患抑鬱症的行為風險因素之一。此實驗中利用體外高解析度呼吸測量儀證實了HA大鼠伏隔核的線粒體功能受損，表現為它們的複合體I活性和最大線粒體呼吸的降低(圖2A) 。
線粒體形態與功能緊密相關，對LA和HA大鼠的伏隔核進行了電子顯微鏡分析，以評估線粒體形態和細胞器間的相互作用 (圖2B)。兩組線上粒體總數上沒有差異(圖2C)，然而HA大鼠表現出更大的線粒體面積(圖2D)和線粒體組織覆蓋率(圖2E)，其形態提示線粒體輕度腫脹。鑑於線粒體-內質網接觸線上粒體功能和動力學以及鈣穩態重要作用，我們分析了線粒體-內質網接觸。發現HA大鼠的線粒體-內質網接觸數明顯低於LA大鼠(圖2F)且HA大鼠表現出更多的線粒體-線粒體接觸(圖2G)。綜上所述，這些結果表明HA和LA大鼠在伏隔核神經元的線粒體功能、形態及其與內質網相關引數上均存在差異。
圖2.差異性狀焦慮與不同的線粒體功能有關
4. 高特質焦慮大鼠伏隔核 MSN中MFN2水平降低
線粒體的形狀及其與內質網的相互作用都受到參與線粒體動力學(即分裂和融合)的分子的調控。線粒體融合蛋白MFN2在與線粒體-內質網接觸中起著重要的調控作用。我們假設HA大鼠的伏隔核MFN2減少，因此測量了伏隔核組織中Mfn2的mRNA水平，發現HA的Mfn2 mRNA表達低於LA大鼠(圖3A)。兩組大鼠的其他融合基因(即Mfn1, Opa1)(圖3B,C)和裂變基因(即Drp1)(圖3D)的相對錶達水平並無明顯差異。WB檢測進一步證實HA大鼠伏隔核組織中MFN2蛋白表達低於LA大鼠(圖3E;圖S2A)， OPA1和DRP1蛋白在兩組中表達水平無差異(圖S2A-C)。
為了量化特定NAc細胞型別中Mfn2的水平研究者進行了RNAscope分析。先前的研究表明伏隔核殼部是焦慮、快感缺乏和被動應對迴路中的關鍵區域。HA大鼠在伏隔核殼部D1和D2受體表達神經元中的Mfn2表達水平均低於LA大鼠(圖3F, G)。免疫組織化學證實，MFN2蛋白在HA大鼠伏隔核殼部表達較低(圖3H，I)，兩組大鼠在大腦皮層以及杏仁核的中央和基底外側區(圖3I)中MFN2蛋白表達無差異。在伏隔核核部， HA大鼠兩種細胞型別的Mfn2均略低於LA大鼠且均無顯著性差異(圖S2D,E)。此外，在缺乏D1和D2受體的細胞中，Mfn2在伏隔核核部和殼部的表達沒有差異(圖S2F)。這些結果支援伏隔核殼MSN 的Mfn2水平降低與HA之間的存在關聯。
圖3.差異特徵性焦慮與不同的線粒體動力學學和MFN2的減少有關
5.在HA大鼠伏隔核中過表達MFN2可使線粒體引數和線粒體-內質網接觸正常化
透過給HA大鼠伏隔核注射AAV病毒，使MFN2蛋白過表達(MFN2 OE)大鼠，試圖透過調控伏隔核MFN2水平來使HA大鼠的細胞和行為恢復正常。將實施假手術的LA（LA-Sham）和HA大鼠（HA-Sham）和MFN2 OE大鼠三者的細胞和行為表型進行比較。與HA-Sham大鼠相比，MFN2 OE HA大鼠伏隔核中Mfn2的mRNA和蛋白表達顯著增加(圖4A，B；圖S3A，B)，並使HA線粒體的呼吸能力恢復到LA-Sham大鼠的水平(圖4C)。
接著檢測了MFN2過表達（OE）對線粒體形態的影響(圖4D)。結果顯示線粒體密度不受焦慮和MFN2過表達的影響(圖4E)，再次證實了焦慮與三組大鼠線粒體面積(圖4F)和覆蓋率(圖4G)以及線粒體-內質網接觸(圖4H)的差異相關。值得注意的是，MFN2過表達減少了HA大鼠線粒體的面積(圖4F)和覆蓋率(圖4G)，增加了線粒體與ER的接觸(圖4H)，從而使HA大鼠的線粒體特徵恢復到LA大鼠的水平。為能準確地計算出單個線粒體的體積，對伏隔核殼部的線粒體網路進行了三維重建。研究者重建了8只大鼠的線粒體網路，結果顯示HA大鼠線粒體總體積比LA大鼠更大，但可透過MFN2 OE使其正常化(圖4I, L)。
當單獨分析樹突區的線粒體時，HA大鼠線粒體總體積的增加更加顯著(圖4M，N)。且線粒體的數量和長度既不受焦慮的影響，也不受MFN2 OE的影響(圖4K，L)。為證實線粒體功能和神經元形態的改變不是由AAV(腺相關病毒)轉染引起的細胞免疫反應所致。將注射pAAV9-hSyn1-GFP-WPRE的大鼠與假手術大鼠相比，未發現線粒體呼吸、關鍵線粒體基因表達或神經元形態計量學引數的任何變化(圖S4)。
圖4. 在NAC中MFN2的過表達使線粒體功能正常化
6. 在HA大鼠伏隔核中過表達MFN2可使神經元和行為表型正常化
接下來探討MFN2 OE對細胞和大鼠行為的影響。HA大鼠的伏隔核MSN的微小興奮性突觸後電流的頻率降低（圖1），但可透過過表達MFN2 使HA大鼠恢復到與LA大鼠相當的水平（圖5A）。此外，MFN2 OE大鼠記錄的電流平均峰值更小，這可能是由於新產生的突觸的突觸後反應減少所致。HA大鼠的MFN2能使HA大鼠較差的樹突分枝和棘突形態恢復到LA大鼠的水平。這與從電生理記錄中獲得的充滿生物素的MSN的共聚焦分析(圖5B-D)和MSN高爾基染色(圖5E,F)結果一致。
伏隔核中過表達MFN2可降低HA動物焦慮和抑鬱相關行為測量，並達到與LA大鼠相當的水平。MFN2 OE大鼠在高架迷宮的開臂停留的時間比HA大鼠更長(圖5G)，表明過表達MFN2有緩解焦慮的類似作用。MFN2 OE大鼠比HA大鼠表現出更強的糖水偏好(圖5H)，且在強迫游泳試驗中不動的時間更短(圖5I)，表明過表達MFN2有緩解抑鬱的作用。這些結果提示伏隔核MSN中Mfn2的表達水平與焦慮相關的線粒體、神經元和大鼠行為學表型之間存在關聯。
圖5.HA大鼠NAc中MFN2OE歸一化細胞和行為表型
結 論
綜上所述， MFN2介導的線粒體和神經元表型改變在調節焦慮和動機行為方面起著至關重要的作用。高焦慮動物表現出抑鬱樣行為增加，伏隔核的線粒體GTP酶 Mfn2表達降低，同時線粒體(即呼吸、體積、與內質網的相互作用)和中型棘突神經元（即樹突複雜性、樹棘突密度和型別、興奮性輸入)也發生了變化。MFN2在伏隔核中的過表達可逆轉線粒體和神經元的表型的改變及HA大鼠焦慮和抑鬱樣行為，MFN2是治療焦慮和相關行為障礙的潛在新靶點。
END
編 譯 / 張 丹 丹
校 審 / 梁 春 梅