炎症性面板病（Inflammatory skin disorders，ISDs）是臨床當中最為常見的一種頑疾，這些疾病大多是面板上皮屏障對過敏原和病原體產生的炎症反應。
代表性疾病包括銀屑病、特應性皮炎（atopic dermatitis，AD），由此引發的全身或區域性紅斑、多層銀白色鱗屑及不同程度的瘙癢，常常反覆發作，經久不愈，這不僅極大地影響了美觀，還會給患者的生理及心理帶來巨大的影響，讓人苦不堪言。
然而，當下供患者選擇的獲批治療方案寥寥無幾。其中，外用糖皮質激素和免疫抑制劑是當前的主流治療方式，如臨床常用的藥物地塞米松。但大多數患者在用藥後，治療效果往往難以達到預期，尤其是長期使用極易產生耐藥問題。
“我們一直在考慮，如何透過藥物製劑的手段來提高糖皮質激素的敏感性，以有效改善糖皮質激素的治療效果。” 浙江大學藥學院教授，博士生導師平淵表示。
近日，平淵團隊創新性地提出了透過基因編輯的治療手段，並結合可溶性微針（microneedle，MN）技術，選擇性靶向敲除與耐藥相關的 NLRP3 基因，可顯著改善銀屑病及特應性皮炎的治療效果。換句話說，NLRP3 基因編輯和糖皮質激素治療相結合（透過 MN 介導的透皮給藥）有望成為治療 ISDs 的一種潛在有效策略。
該研究成果於 3 月 10 日發表在《科學進展》（Science Advances）雜誌上，標題為《微針輔助基因編輯：一種透過 CRISPR-Cas9 靶向 NLRP3 基因的透皮策略用於協同治療炎症性面板疾病》（Microneedle-assisted genome editing: A transdermal strategy of targeting NLRP3 by CRISPR-Cas9 for synergistic therapy of inflammatory skin disorders）。
可溶性微針製備：膠原三肽、透明質酸為基體材料
以往研究表明，NLRP3 炎症小體（nod-like receptor family, pyrin domain–containing 3）啟用後會增加免疫相關細胞的糖皮質激素的耐藥性。由於其存在面板的表皮及真皮層，這就意味著，目前研發靶向 NLRP3 炎症小體的相關藥物很難透過面板吸收，抑制其活性，最終治療效果也時常不盡人意。
為了進行有效給藥，平淵及其團隊選擇了一種更加強效、直接的破局之路 —— 研發了專門用於治療 ISDs 可溶性微針貼片，可以直接透過面板角質層等屏障，在表皮及真皮層降解釋放並遞送基因編輯藥物製劑，從而達到高效治療的目的。
“這項研究工作從開始到完成一共耗費了約兩年的時間，前期的困難主集中於透皮製劑的製備與最佳化，以及如何修復炎症引起面板損傷組織。” 平淵說道。
MN 貼片的設計包含三個組成部分：
（1）聚合物 / Cas9 核糖核蛋白（RNP）奈米複合物，用於 Cas9 的胞內遞送，靶向 NLRP3 炎性小體；
（2）地塞米松（Dex）負載的聚合物奈米粒子，用於改善糖皮質激素治療；
（3）含有 Cas9 奈米複合物和 Dex 奈米顆粒的可溶性 MN 貼片，用於經皮共給藥。
具體而言，MN 貼片是透過微模塑的方法從生物相容性的透明質酸（hyaluronic acid，HA）和膠原三肽（collagen tripeptide，CTP）的水溶液中製備的。製備的 MN 陣列貼片的尺寸為 8 mm × 8 mm，15 × 15 的 MN 陣列。掃描電子顯微鏡（SEM）影象顯示，MN 為錐體，基底直徑為 200 μm，高度為 600 μm，形貌完整、均勻。
研究發現，CTP 濃度從 0 增加到 10% 時會對 MN 的剛度產生影響。含 10% CTP 製成的 MN 貼片的機械強度為 1.5 N / 針，高於不含 CTP 的 MN 貼片（0.9 N / 針）。
此外，含 10% CTP 的 MN 貼片與含 20% CTP 的 MN 貼片在機械強度上沒有顯著差異。這樣製備出的 MN 貼片具有優異的力學效能，擁有足夠的剛度確保面板的插入和滲透。然而當 CTP 含量從 10% 增加到 30% 時，MN 表面的粗糙度發生了明顯的變化。
因此，平淵團隊選擇 HA 和 10% CTP 作為基體材料，製備出的 MN 貼片不僅具有良好的生物相容性，還能促進膠原合成，減少經皮水分流失，促進面板病變的組織修復。因此，可溶性 MN 貼片可以極大地促進這兩種納米制劑的透皮給藥。
可溶性微針可持續給藥，顯著改善炎症表現
為了研究 MN 貼片在體內的降解水平，平淵團隊分別評估了羅丹明（rhodamine，一種紅色熒光染料）和標記異硫氰酸熒光素（FITC，一種綠色熒光染料）的基因編輯蛋白 Cas9 分別從從聚乳酸 - 羥基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA）及 Cas9 載體中的釋放行為。
將 MN 貼片插入到小鼠面板後，發現 MN 能迅速吸收面板中組織液並迅速溶解，同時能夠觀察到羅丹明和 Cas9-FITC 在表皮和真皮區域的分佈情況。這些結果表明 Dex 和 Cas9 蛋白質納米制劑在體內的持續性釋放，證明 MN 貼片可以作為一個藥物儲庫，在面板內能夠持續釋放治療藥物。
圖 | 雙載 MN 系統的面板穿透及釋放情況（來源：Science Advances）
為了評估 MN 貼片對面板炎症的治療作用，他們首先將 2,4 - 二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB）塗在裸露的背側面板上，造成典型的病變，如面板乾燥、嚴重紅斑、出血、瘢痕、水腫、抓痕、糜爛等，從而建立 AD 小鼠模型，然後在區域性連續 5 周塗敷 MN 貼片。
實驗證明，負載 CP/Ad-SS-GD/ Cas9 或 PLGA/Dex 的 MN 貼片能夠適度緩解 AD 症狀，其療效與市面使用的 Dex 乳膏或他克莫司軟膏相當。而雙載 MN 貼劑（載有 RNP 和 DEX）的抗炎能力最強，小鼠面板的水腫、出血、紅斑、抓痕和侵蝕明顯減輕。
此外，在連續使用 MN 貼片治療 5 周後，可以觀察到小鼠背部的毛髮再生。在治療期間，使用 MN 貼劑治療的小鼠沒有記錄到顯著的體重減輕，這表明在未來的臨床轉化中其具有較好的安全性。
瘙癢是 AD 的主要症狀，夜間睡眠時，瘙癢會加劇，從而嚴重影響了生活質量。在 AD 模型小鼠中，後肢抓撓與瘙癢感相關，瘙癢緩解作為 AD 恢復的標誌，是判斷治療是否成功的關鍵指標。與對照組相比，他們發現負載 Cas9 RNP 或 Dex 的 MN 貼片均能顯著減輕 AD 小鼠的抓撓行為。
正如預期的那樣，由於 NLRP3 基因破壞和糖皮質激素治療的協同治療作用，雙載 MN 貼劑對瘙癢表現出最強的抑制作用。經過臨床評分，發現採用雙載 MN 貼片治療後，小鼠皮炎的嚴重程度明顯降低，這說明 MN 貼片在治療 AD 時的優異效能。
圖 | 雙載 MN 貼片緩解 DNCB 誘導的 AD 症狀（來源：Science Advances）
“目前臨床常用的治療牛皮癬和特應性皮炎的製劑為地塞米松乳膏及他克莫司軟膏。與這兩款製劑相比，我們的優勢在於透過微針技術高效透過面板的角質層屏障。此外，可溶性微針含有膠原三肽，可以促進面板損傷組織的與膠原合成，促進皮損組織的修復。” 平淵指出。
談及此次研究的應用場景與產業化趨勢，平淵表示，此次研發的微針貼皮未來可應用於感染性面板病，如痤瘡、面板真菌病等；其他病原體感染相關面板病以及其他自身炎症性面板病，比如自身免疫性表皮下蕁麻疹；面板因紫外光照射而老化的症狀，以及面板醫美相關的場景。
並強調道，目前已有一些高新科技生物公司在對微針技術轉化及產業化進行了大量臨床前研究，他們相信這種技術在未來會有廣闊的前景和市場。
利用基因編輯手段，突破炎症性面板病治療的核心難題
除了選用可溶性微針直接給藥之外，該研究另外一大巧妙之處就在於利用了第三代基因編輯 CRISPR/Cas9 技術，直接精準敲除了 NLRP3 基因，有效降低了 NLRP3 炎症小體的表達。
透過基於 CRISPR-Cas9 的基因編輯對 NLRP3 炎症小體的直接破壞，不僅可在 DNA 水平上抑制了 NLRP3 的啟用，而且避免瞭如小分子抑制劑常見的脫靶效應。
他們最近開發的聚合載體使 Cas9 RNP 能夠在細胞內高效遞送，確保了 NLRP3 基因在皮下角質形成細胞和免疫細胞中的高效基因組編輯。
同時，NLRP3 炎症小體的破壞可以進一步提高糖皮質激素治療的敏感性。由於 Dex 在其入核過程中能夠誘導核孔擴張，因此它在細胞內的遞送將同時有助於基因組編輯劑的核進入。
平淵告訴 DeepTech，其課題組一直致力於基因編輯遞送載體的研發及相關疾病的治療，也一直在探索是否可以利用基因編輯技術來解決炎症性面板病的治療。同時，在浙江大學藥學院顧臻教授課題組微針貼片在透皮給藥製劑方面的工作，以及華南理工大學王均教授課題組在炎症小體敲除後治療炎症性疾病的啟發之下，他們最終決定嘗試利用課題組自己研發的基因編輯遞送載體，結合微針給藥技術，來治癒炎症性面板病。
之所以選擇利用基因編輯手段進行醫藥研究，與平淵個人的研究背景密切相關，更與研究團隊成員的集體努力分不開關係。
平淵在新加坡攻讀博士期間主要從事基因遞送的載體研究，並關注非病毒載體在基因治療方面的應用。但那時候基因治療方興未艾，並未有突破性的技術進展。
直到 2012 年以 CRISPR/Cas9 為基礎的基因編輯技術問世，並迅速拓展至基因治療領域，彼時的他正在新加坡南洋理工大學從事博士後研究，當時曾有意識地關注基因編輯領域的動向。
2015 年被新加坡南洋理工大學聘為資深研究員，主要從事仿生蛋白作為藥物遞送載體的研究。直到 2017 年 10 月以浙江大學 “百人計劃” 引進人才的身份加盟浙江大學，並組建自己的研究小組，自此正式開始主攻基因編輯遞送技術及疾病治療。
而目前，他感興趣的領域是基因編輯非病毒載體，並在疾病與基因治療中的應用。由於病毒病毒載體存在安全性和免疫原性的問題，如最近有報道慢病毒載體在治療地中海貧血患者出現了嚴重的安全性問題，如急性髓細胞白血病及骨髓增生異常綜合症，所以他們將目光轉移到非病毒載體的研究，提高非病毒載體的安全性，併兼顧其有效性。
下一階段，他們希望透過研發出安全的非病毒基因載體，針對一些罕見病，如苯丙酮尿症及酪氨酸血癥，展開治療研究。