撰文 | Qi
責編 | 兮
哺乳動物細胞透過稱為缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factors, HIFs）的轉錄調節因子對氧氣不足做出反應。儘管具有短暫的保護作用，但長期的HIF啟用會在不同組織中驅動不同的病理反應，例如促進肥胖症患者的炎症和胰島素抵抗以及阻止早產兒白質形成等【1,2】。這種細胞功能障礙很大程度上歸因於所有細胞型別共享的經典低氧應答的啟用時間延長。然而，難以解釋的是保守的缺氧特徵基因如何導致多樣的細胞表型。
近日，來自美國凱斯西儲大學醫學院的Paul J. Tesar課題組在Cell Stem Cell 雜誌上發表了一篇題為“Non-canonical Targets of HIF1a Impair Oligodendrocyte Progenitor Cell Function” 的文章，作者使用衍生於多能幹細胞的少突膠質細胞祖細胞（oligodendrocyte progenitors, OPCs）中慢性HIF1a累積模型，證明HIF1a可以透過啟用非經典靶標以損害OPCs來源的少突膠質細胞的產生。在這項工作中，作者以少突膠質細胞為例，確立細胞型別特異性的HIF1a靶標干擾特定型別細胞應答低氧功能的觀點，對於其他組織細胞型別缺氧應答的研究具有借鑑意義。
首先，為了探索HIF介導的少突膠質細胞發育阻斷的潛在機制，作者在小鼠多能幹細胞衍生的OPCs中生成了慢性HIF1a積累的細胞模型。由CRISPR-Cas9介導的Vhl敲除的OPC（sgVhl OPC）與低氧條件下培養的OPC在蛋白質和RNA水平上反應相似。那麼，HIF1a累積是OPC分化的泛抑制劑還是特異性抑制劑呢？作者刺激sgVhl OPCs形成星形膠質細胞或少突膠質細胞，對兩種細胞型別標誌物染色，證明HIF1a的作用是少突膠質細胞特異性的，隨後透過對其分化不同階段標記物進行染色顯示，所有階段標誌物的獲取均發生延遲。因此，這些資料表明HIF1a的累積會特異性的破壞OPC的早期分化，從而延遲少突膠質細胞和髓磷脂的形成。
為了確認負責特異性阻斷少突膠質細胞發育的HIF1a的基因靶標，作者主要透過ChIP-seq繪製全基因組染色質結合圖譜，以及與小鼠其他細胞型別資料集的比對，發現OPCs特定HIF1a峰下譜系特定轉錄因子Olig2的基序高度富集，而不富集於其他任何組織特異性HIF1a峰，進一步的免疫共沉澱也證實HIF1a與Olig2的物理相互作用。此外，作者還發現一種從OPCs分化為少突膠質細胞所需的轉錄因子Sox10及其下游靶基因Plp1和Pdgfra在sgVhl OPC中發生降低，而其他譜系轉錄因子保持不變。值得注意的是，HIF1a並不與之結合，表明HIF1a是透過啟用“其他基因”靶標來間接抑制Sox10從而阻斷少突膠質細胞的發育。
圖1，OPC特異性的HIF1a靶標鑑定方法及結果
接下來，作者想知道HIF1a直接作用的“其他基因”，將重點放在屬於OPCs特異性且HIF1a非經典靶標的排名靠前的Ascl2和Dlx3兩個基因上。使用CRISPR啟用（CRISPR activation, CRISPRA）技術在OPCs中異位表達Ascl2和Dlx3足以損傷分化過程中早期（O4+），中間（O1+）和晚期（MBP+）少突膠質細胞標記物的獲取，且導致Sox10表達水平顯著降低。已知ASCL2會損害體細胞幹細胞的分化，並可以在關鍵分化基因上起阻遏作用，那麼 ASCL2是否同樣可以直接結合到Sox10的上游調控區域發揮分化阻斷作用呢？作者透過CHIP-seq發現， ASCL2能夠直接結合Sox10的上游增強子並減少Sox10的表達。值得注意的是，RNAi介導的sgVhl OPC中Ascl2或Dlx3的分別敲低並不能挽救少突膠質細胞的形成，提示這些非經典HIF1a靶標可能需要共同作用以抑制Sox10表達並損傷OPCs向少突膠質細胞的形成。
為了確定可能克服HIF1a施加的分化障礙的潛在通路，作者試圖篩選出能夠增加sgVhl OPC中MBP+少突膠質細胞形成能力的生物活性化合物。其中，MEK/ERK抑制劑在篩選中富集並能增導致少突膠質細胞形成增加。那麼，MEK抑制作用是透過直接改善HIF1a積累情況還是調節其下游靶點來影響sgVhl OPC的分化呢？作者使用經測試的最有效MEK抑制劑300nM AZD8330處理細胞持續14小時，並不會改變HIF1a的核累積。此外，HIF1a的下游直接靶標Ascl2和Dlx3也並未增加MEK/ERK訊號的啟用。因此，這些資料提示MEK抑制劑處理是透過繞過HIF1a及其直接下游靶標的方式來影響少突膠質細胞的分化。
基因集富集分析（Gene set enrichment analysis, GSEA）顯示AZD8330對sgVhl OPC的處理導致“少突膠質細胞分化”和“少突膠質細胞發育”通路的富集，且對少突膠質細胞分化至關重要的兩個基因Sox10和Myrf表達降低。考慮到MEK抑制劑並不干涉HIF1a及其下游靶基因的表達，那麼它所介導的Sox10表達增加的情況似乎不太可能對sgVhl OPC具有特異性。與此假設一致，在用300 nM AZD8330處理14小時的Cas9對照OPC中，Sox10表達也同樣增加。但需要注意的是，MEK抑制劑會導致sgVhl OPC中少突膠質細胞的形成顯著增加，而對對照OPC卻幾乎沒有影響，這突顯了HIF1a所施加的背景特異性阻斷作用。以上資料表明，HIF1a累積引起的Sox10表達降低對於少突膠質細胞分化中HIF介導的阻滯至關重要，在不改變sgVhl OPC中經典HIF功能的情況下恢復Sox10表達可恢復少突膠質細胞的形成。
最後，為了評估MEK抑制在低氧人腦OPC中的作用，作者利用先前建立的從多能幹細胞中產生能夠進行髓鞘形成的大腦類器官的方法【3】。首先透過低氧探針（hypoxyprobe）定義類器官低氧區域的免疫組化證明，SOX10的表達顯著受損。隨後使用DMSO或300 nM AZD8330處理類器官，再次使用低氧探針處理並收集樣品進行分析。結果顯示，與類器官內的正常氧區相比，低氧區域的MYRF+少突膠質細胞數量顯著減少了2.8倍，而AZD8330的處理導致低氧區域內少突膠質細胞的數量顯著增加1.8倍。這些結果共同表明，氧張力會影響少突膠質細胞的發育，而MEK抑制克服了在人腦發育的3D模型中低氧介導的少突膠質細胞形成的抑制作用。
圖2，MEK抑制劑可以恢復類器官中低氧區域少突膠質細胞形成能力
總的來說，在這項研究中作者對OPC中HIF1a的全基因組功能靶標進行了分析，發現HIF1a不僅與多種細胞型別共享的典型缺氧反應基因結合，而且還以細胞型別特異性方式激活了一組獨特的非典型基因。然而，MEK/ERK訊號調節Sox10表達的機制仍然未知，驗證非經典HIF1a靶標的作用對於未來的研究和臨床治療都將十分重要，例如早熟瀰漫性白質損傷和成人白質中風。此外，瞭解除OPC之外的其他細胞型別特異性的HIF1a靶點是否是低氧介導的功能障礙的關鍵驅動因素，也將是十分有趣的研究內容。
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.09.019
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參考文獻
1, Lee, Y.S., Kim, J.W., Osborne, O., Oh, D.Y., Sasik, R., Schenk, S., Chen, A., Chung, H., Murphy, A., Watkins, S.M., et al. (2014). Increased adipocyte O2 consumption triggers HIF-1a, causing inflammation and insulin resistance in obesity. Cell 157, 1339–1352.
2, Scafidi, J., Hammond, T.R., Scafidi, S., Ritter, J., Jablonska, B., Roncal, M., Szigeti-Buck, K., Coman, D., Huang, Y., McCarter, R.J., Jr., et al. (2014). Intranasal epidermal growth factor treatment rescues neonatal brain injury. Nature 506, 230–234.
3, Madhavan, M., Nevin, Z.S., Shick, H.E., Garrison, E., Clarkson-Paredes, C., Karl, M., Clayton, B.L.L., Factor, D.C., Allan, K.C., Barbar, L., et al. (2018). Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nat. Methods 15, 700–706.