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機體在遭受外源性病毒或者細菌入侵後，往往會伴隨有感染性休克的症狀進而威脅病人的生命安全。經典的理論認為體內的巨噬細胞產生大量的炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等形成的“炎症風暴”是導致休克的重要誘因。但是，臨床統計學研究卻表明二者之間的相關性只有39%。另一方面，近些年來細胞焦亡這樣一種新型細胞程式性死亡也被多篇文章報道參與了感染性休克的發生發展中，而在感染性休克的程序中，除了這些細胞焦亡或者炎症訊號外，合併產生的多種併發症如在病理情況下內源性物質代謝紊亂所造成的物質蓄積加重感染性休克程序的作用和確切分子機制仍然不明。
2020年12月11日，中國藥科大學的郝海平團隊在Cell Metabolism雜誌上線上發表了題為：Apaf-1 Pyroptosome Senses Mitochondrial Permeability Transition的研究論文，該研究從線粒體膜通透性轉換（MPT）的角度揭示了肝細胞、免疫細胞感知DAMPs促發細胞焦亡的病理分子機制，首次揭示線粒體感知不同應激條件下，透過Apaf-1選擇性招募活化caspase-4引發細胞死亡的機理。相較於MOMP引發的經典細胞凋亡小體（Apaf-1/Caspase-9）組裝，MPT促使Apaf-1與Caspase-4結合形成一種新的蛋白複合體，作者將之定義為“焦亡小體複合物”，該複合物可進一步啟用caspase-3-GSDME訊號通路導致快速的細胞焦亡，這種快速的細胞死亡途徑是膽淤狀態下肝衰竭的重要分子病理基礎。該研究發現了一種新型線粒體細胞焦亡途徑，為線粒體感知損傷相關模式分子（DAMPs）引發細胞焦亡提供了科學解釋，拓寬了對於肝衰竭疾病發生機制的認識，對將來藥物干預感染合併膽淤病人肝功能損傷有重要意義。
膽汁酸引發caspase-4以及GSDME依賴性的細胞焦亡
在該研究中，作者首先運用細胞毒性/炎症因子釋放檢測、透射電鏡、共聚焦顯微鏡觀察細胞形態學變化等多種手段，發現膽汁酸DCA（脫氧膽酸）/CDCA（鵝去氧膽酸）能夠誘導caspase-4（caspase-11, 鼠源蛋白）介導的巨噬細胞焦亡，進一步探究表明，細胞焦亡執行分子由caspase-3作用底物GSDME所介導，而非caspase-4的作用底物GSDMD，並且caspase-3/GSDME訊號也依賴於caspase-4，進而發現了膽汁酸啟用的一種新的細胞焦亡途徑，該途徑由caspase-4/caspase-3/GSDME訊號通路介導。
MPT介導膽汁酸引發的細胞焦亡訊號
那麼，在膽汁酸的刺激下，細胞內caspase-4又是怎樣被啟用的？作者首先排除了膽汁酸與caspase-4的直接相互作用，提示膽汁酸以間接的方式啟用caspase-4以及caspase-3-GSDME訊號。考慮到線粒體應激在調控細胞凋亡以及壞死中的作用，尤其是高濃度膽汁酸可能會引發線粒體鈣超載現象導致線粒體膜通透性發生變化產生應激。作者首先篩選了線粒體膜通透性轉化孔（MPTP）關鍵組成蛋白的抑制劑，發現有且只有線粒體內膜腺苷酸轉運體(ANT)蛋白的抑制劑米酵菌酸（BKA）能夠顯著阻斷上述焦亡訊號通路以及最終的細胞焦亡現象，作者進一步將ANT亞型ANT1和ANT2蛋白敲低，證實了ANT1介導的MPT是膽汁酸激發細胞焦亡訊號的關鍵因素。
MPT透過Apaf-1/caspase-4蛋白複合體引發細胞焦亡
接下來，作者發現在MPT所引發的線粒體應激下，線粒體瞬時釋放較高濃度的ATP以及細胞色素C至胞漿，是促使Apaf-1招募caspase-4形成 “焦亡小體複合物”的關鍵因素。Co-IP、pull-down、confocal共定位實驗均證實Apaf-1與caspase-4在高劑量膽汁酸刺激下產生了相互作用，敲除細胞內Apaf-1基因，caspase-4/ caspase -3/GSDME訊號通路及細胞焦亡率均受到顯著抑制。此外，作者在重組蛋白分子水平也證實，在外源性加入細胞色素C與高劑量的ATP後，Apaf-1能夠結合並活化caspase-4。有意思的現場是，該焦亡複合體中產生的活化caspase-4片段並不能剪下GSDMD，而是剪下啟用caspase-3，這也解釋了上述細胞內觀察到現象：為什麼膽汁酸啟用caspase-4介導的細胞焦亡是透過GSDME蛋白執行的。進一步透過最適分子配比酶活性檢測以及分子排阻色譜（SEC）實驗發現“焦亡小體”複合體中Apaf-1與caspase-4的構成比為7：2，不同於凋亡小體中的7：4。考慮到Apaf-1也是細胞凋亡中凋亡小體Apaf-1/caspase-9的核心組成成分，作者進一步透過動態監測不同的細胞死亡刺激條件下caspase蛋白活化、胞漿細胞色素C與ATP釋放水平，發現高劑量膽汁酸或者ANT1通道開放劑氯尼達明（LND）等MPT啟用劑可以在短時間內啟用焦亡相關的caspase-4、caspase-3，而凋亡誘導劑阿黴素（DOX）或者低劑量的膽汁酸只能引發經典的細胞凋亡，這些弱刺激因素需在較長時間條件下才能啟用caspase-9，而且細胞色素C釋放延滯，胞漿中無明顯的ATP釋放峰。這部分研究提示，不同的應激因素透過促發線粒體MOMP或者MPT，從而選擇性啟用細胞凋亡/焦亡訊號通路，而MPT及下游Apaf-1/caspase-4焦亡小體的形成需要更強烈的刺激。
Caspase-11/caspase-3/GSDME介導的細胞焦亡是膽汁淤積性肝損傷的關鍵病理機制
最後，為進一步證實上述分子機制在急性肝損傷中的作用，該團隊利用膽管結紮手術（BDL）造成肝內膽汁淤積來模擬膽瘀相關的急性肝衰竭。研究發現膽汁淤積後，小鼠肝臟組織線粒體也發生了MPT，表現為線粒體內嵴結構消失。進一步比較野生型（WT）與Caspase-11-/-小鼠血清中炎症因子IL-1α/β以及肝組織中caspase-3-GSDME訊號通路均證實BDL模型所造成的肝損傷依賴於caspase-11（對應於人源蛋白caspase-4）。與此同時，GSDME-/-也能夠抑制小鼠血清相關因子的釋放，幾乎能逆轉急性膽汁淤積性肝衰竭的致死率。
綜上，該研究揭示了感染合併膽汁淤積或者在非感染性情況下，內源性物質啟用細胞焦亡造成組織器官衰竭的新分子機制；Apaf-1/caspase-4焦亡小體的發現一方面科學解釋了MPT引發細胞壞死的分子機制，另一方面對於理解內源性非感染因素促發器官衰竭具有重要意義。此外，對後期開發細胞焦亡抑制劑，用於臨床上由於細胞焦亡所造成的器官組織衰竭的藥物治療具有重要應用價值。
中國藥科大學郝海平教授、曹麗娟副研究員為本文的共同通訊作者，許萬峰博士、車遠博士為本文的共同第一作者。
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.11.018