導讀 阿爾茨海默病（AD）是一種進行性、不可逆的腦部疾病。AD的一個顯著特徵是一種叫做澱粉樣蛋白（Aβ）的蛋白質異常高積累，在大腦中形成獨特的塊狀物稱之為 "斑塊"。大腦中的小膠質細胞，能識別感染、有毒物質和損傷的細胞，並透過清除這些物質來保護神經細胞。小膠質細胞功能障礙是阿爾茨海默病的關鍵病理特徵。
近期，在elife期刊發表了《Fibrillar Ab triggers microglial proteome alterations and dysfunction in Alzheimer mouse models》的研究論文。作者對澱粉樣蛋白β（Aβ）病理學的兩個小鼠模型（過表達APPPS1和敲入APP-NL-G-F（APP-KI））中小膠質細胞進行了深入和時間分辨的蛋白質組學表徵。標註了一組小膠質細胞Aβ反應蛋白群（MARPs），它們反映了Aβ沉積早期、中期和晚期階段小膠質細胞變化的異質性，並在APPPS1小鼠中出現較早。
令人驚訝的是，蛋白質組的動力學差異與Aβ纖維的存在有關，而不是營養不良的神經軸突，提示原纖維抗體可能觸發AD相關的小膠質細胞表型和觀察到的功能下降。鑑定出的AD小膠質蛋白質組學特徵為新型分子靶標的功能研究和監測AD進展或治療效果的潛在生物標誌物提供了參考。
1. 與APP-KI小膠質細胞相比，APPPS1小膠質細胞更早地形成與AD相關的蛋白質組學特徵在APPPS1和APP-KI的小鼠模型中，澱粉樣斑塊沉積出現在相似的年齡段（6-8周）。為了揭示不同澱粉樣蛋白沉積階段小神經膠質蛋白組的動態改變，作者分析了分別來自1，3，6和12個月大的APPPS1和APP-KI小鼠的小膠質細胞，以及其年齡相匹配的野生型（WT）小鼠（圖1）。
為了便於進行蛋白質組分析，作者首先優化了小神經膠質的分離程式，利用MACS技術從小鼠大腦中分離出CD11b陽性的小膠質細胞，然後，優化了微膠質蛋白組分析的資料採集方法。12個月齡小鼠的APPPS1小膠質細胞顯示了776種顯著的上調蛋白和633個下調蛋白，而APP-KI小膠質細胞顯示了704個上調蛋白和666個下調蛋白。總的來說，資料顯示，在這兩種小鼠模型中，澱粉樣蛋白斑塊的積累導致小神經膠質向AD相關表型發展，但是，APPPS1和APP-KI小膠質細胞的反應動力學是不同的。
圖1 急性分離的小膠質細胞的定量蛋白質組學
2.MARPs的識別作為早、中和晚期澱粉樣蛋白階段的標誌作者測定了在Aβ蛋白沉積的早期、中期和晚期首先出現的蛋白質改變，以及在所有的分析階段發生的變化，並一直追蹤著澱粉樣蛋白的積累。為此，作者選擇了APPPS1小鼠模型作為參考，因為它能顯示早期的變化，相較於APP-KI，APPPS1小鼠模型能提供一個更好的關於蛋白質改變澱粉樣蛋白反應的時間解析度（圖2A）。
早期組的小膠質細胞Aβ反應蛋白群（MARPs）包括幾個先前確定的轉錄DAM標記物比如ITGAX (CD11c), APOE, CLEC7a, LGALS3 (Galectin-3) 和CD68 （圖2B）；中期組的MARPs包括上調的蛋白質如FABP3, FABP5, CD63, TREM2, MIF 和GUSB（圖2C）；晚期的MARPs表達只有在廣泛的澱粉樣蛋白病理時才會發生改變的蛋白質，該組包括參與鈣離子結合的上調蛋白質，比如NCAN,MYO5A, HPCAL4, TTYH1和GCA以及在內吞/溶酶體系統中發揮作用的下調蛋白比如TFEB, TFE3和BIN1，還有不同的G蛋白偶聯受體訊號蛋白包括GNG2, GNG5和GNG10也顯示丰度下降（圖2D）。
圖2 早期、中期和晚期MARPs
早期的MARPs基因本體(GO)簇富集分析顯示， 上調的蛋白富含免疫反應、病毒反應、干擾素β和細胞因子反應、抗原處理和呈遞以及生物和脂質反應（圖3）。
圖3 MARPs生物過程（BP）的基因本體富集簇分析
綜上，作者的研究提出該組學特徵可用來跟蹤小膠質蛋白組，並且提供了一種資源，該資源可以在Aβ積累的不同階段中映射出大腦免疫力的變化。
3.斑塊相關的小膠質細胞中檢測到的蛋白質組變化作者透過使用從12個月齡的APPPS1和APP-KI小鼠的小膠質細胞中分離出來的小膠質細胞進行Western blot分析，驗證了蛋白質組的變化。該分析證實了相較於WT小鼠，在兩種轉基因小鼠模型中早期MARPs APOE和CD68的明顯增加，中位MARPs TREM2和FABP5以及領先的MARP CSF1R的水平降低（圖4）。
圖4 12個月APPPS1和APP-KI小鼠的定量和調節蛋白
此外，為了視覺化APPPS1和APP-KI小鼠中改變的小膠質蛋白的空間分佈，蛋白質組學的變化也透過免疫組化驗證。對3個月大的APPPS1小鼠進行免疫組織學分析，已經發現選定的MARP，如CLEC7a（圖5），TREM2, APOE的免疫反應性增強，標誌著AD中小膠質啟用的初始階段。
圖5 小膠質細胞CLEC7a在3個月大的APPPS1小鼠中明顯上調
這些增長在IBA1陽性的小膠質細胞中檢測到， 而這些小膠質細胞聚集在澱粉樣蛋白斑塊上，但在離斑塊更遠的小膠質細胞中沒有，並且在3個月大的APP-KI小鼠中不那麼明顯（與其蛋白質組資料一致）。
據此，與WT小鼠相比，在12個月時，APPPS1和APP-KI小鼠都顯示出選定的MARP CLEC7a的水平有類似的增加（圖6），TMEM119的水平有所下降。這些資料表明，小膠質細胞和Aβ之間的相互作用很可能觸發蛋白質組的變化，因為它們可以在斑塊相關的小膠質群體中觀察到。
圖6小膠質細胞的CLEC7a在12個月齡的AD小鼠模型中均有增加TMEM119在12月齡的兩種AD小鼠模型中均下調
4.APPPS1和APP-KI小鼠在澱粉樣斑塊沉積中呈現相同的動態變化，但在斑塊纖維化方面存在差異小膠質蛋白質組的變化幅度與伴隨著疾病發展而積累的Aβ斑塊有關。儘管在兩種小鼠模型中觀察到的斑塊負荷相同（圖1C、D和圖2A），但是MARP標記的基因表型在不同的小鼠模型中是不同的，並且在APPPS1小鼠中發生較早。因此，在APPPS1和APP-KI的小鼠模型中，澱粉樣蛋白斑塊的性質似乎是不同的。
在3個月齡的APP-KI小鼠中幾乎檢測不到纖維素Aβ（圖7），APP-KI小鼠中纖維素Aβ的數量在6個月和12個月時增加，但與APPPS1小鼠相比總體上仍然較低。因此，作者展示了APPPS1和APP-KI小鼠模型在3個月齡時Aβ斑塊纖維化的突出差異。
圖7 與APP-KI斑塊相比APPPS1小鼠的Aβ斑塊顯示出更高的纖維狀Aβ含量
5.膠質的募集與纖維素Aβ相關為了確定在AD中是什麼原因導致的小膠質細胞的反應，作者首先在兩種小鼠模型中量化了小膠質增加到的Aβ斑塊，該分析是在早期病理階段（3個月）進行的，作者發現了蛋白質組調節的突出差異（圖1C、D和圖2A），以及纖維素Aβ的量都有明顯差異（圖7A、B）。免疫組織化學分析顯示，在APPPS1小鼠中，IBA1陽性的小膠質細胞募集到大的ThR陽性原纖維Ab聚集體中（圖8A）。
量化分析顯示，相較於APP-KI小鼠，在APPPS1小鼠中的Aβ斑塊周圍，IBA陽性的小膠質聚集增加， 儘管他們的整體較大的Aβ斑塊大小支援纖維狀Aβ構象導致小膠質的聚集，而不是斑塊的大小（圖8B、C）。
同樣，作者觀察到，與APP-KI小鼠相比，APPPS1的Aβ斑塊周圍的CD68免疫反應增加了， 然而，在兩個模型中，斑塊附近的每個小膠質細胞的CD68訊號是相似的。總的來說，作者推測小膠質的增加可能是由澱粉樣蛋白斑塊的纖維Aβ含量引起的，從而驅動MARP訊號的獲得。
圖9 纖維狀Aβ在3個月大的APPPS1小鼠中觸發更高的小膠質細胞募集，並與吞噬功能障礙相關
6.吞噬細胞的損傷與MARP標誌物的出現有關APPPS1和APP-KI小鼠在小膠質細胞對澱粉樣蛋白的反應動力學中觀察到的差異促使作者研究小膠質細胞吞噬功能與MARP訊號特徵之間的關聯。為此，作者使用E.coli-pHrodo攝取測定法評估了3個月和6個月大的APPPS1和APP-KI小鼠與相應年齡匹配的WT小膠質細胞的吞噬能力。在3個月大的APPPS1小膠質細胞中檢測到吞噬功能障礙，並且能夠分離的CD11b陽性細胞數量減少。
值得注意的是，APPPS1吞噬功能障礙在6個月大的小膠質細胞中沒有進一步改變，這表明透過大腸桿菌攝取測定法測得的小膠質細胞功能缺陷已在3個月大時完全確立，並具有早期MARP的特徵。相反，APP-KI小膠質細胞在3個月時仍保持功能，但在6個月時表現出與APPPS1小膠質細胞相似的損傷（圖9）。總的來說，作者觀察到小鼠模型之間小膠質功能障礙的不同動力學，這與MARP的出現以及原纖維Aβ的存在有關。
小結研究表明，小膠質細胞的改變是作為對Aβ沉積的反應而觸發的，因為沉積前階段沒有揭示蛋白質組的變化。TREM2-APOE調節機制的改變支援了向MARP的轉化。AD小膠質細胞表現出明顯的干擾素刺激、抗原遞呈增加、細胞表面受體改變、脂質穩態和代謝。小膠質細胞的這些蛋白質組學變化似乎是對纖維Aβ的反應，反映在變形小膠質細胞的形態和吞噬能力受損。作者的蛋白質組資料集提供了一個有價值的研究資源，提供了Aβ沉積不同階段的小膠質細胞變化資訊，未來或許可用於監測小膠質細胞修復策略的治療效果。