撰文 | 言笑
#發育生物學#
哺乳動物胚胎的發生始於一個全能受精卵，逐漸發育成桑葚胚，然後形成囊胚（blastocyst）。囊胚的外胚層（epiblast, EPI）將發育為胚體和羊膜，滋養外胚層（trophectoderm, TE）和原始內胚層（primitive endoderm, PE）則分別發育為胎盤和卵黃囊。TE由滋養層細胞（trophoblasts, TRs）組成，是一種充滿液體的上皮胞囊。EPI被不對稱地放置在TE胞囊中，其位置定義了第一發育軸polar-mural，也稱為embryonic-abembryonic（圖1A）。緊鄰EPI的TE（polar TE）增殖並自我更新，進而逐漸將胎盤構建成一個複合器官，履行關鍵功能（例如氣體交換、廢物排洩和免疫功能）；與EPI分離的TE（mural TE）與TE分化、增殖減少以及附著在子宮上的能力有關。因此，囊胚腔的一個功能是分離將形成胎盤或介導初始子宮附著的TRs庫。為了應對囊胚植入，子宮細胞增殖並經歷功能變化以產生蛻膜。蛻膜為胚胎植入、胎盤發育提供營養和免疫豁免，是子宮內膜基質細胞為適應妊娠而發生的形態學及生理學改變。錯誤的蛻膜化與不孕和流產有關【1】。
在囊胚中，滋養層細胞的模式化確保了成功的植入和胎盤發育。近日，來自奧地利科學院分子生物技術研究所的Nicolas C. Rivron團隊在Cell Stem Cell雜誌在線發表了題為Epiblast inducers capture mouse trophectoderm stem cells in vitro and pattern blastoids for implantation in utero的文章。研究人員鑑定了一組由外胚層分泌的最優誘導劑（FGF4、TGFβ1、IL11、Activin、Bmp7、LPA、8-Br cAMP），可在體外獲得穩定、高度自我更新的類似於囊胚期的小鼠滋養外胚層幹細胞（trophectoderm stem cells, TESCs）。TESCs具有更強的形成胚狀體（Blastoids, 囊胚樣結構）的能力，能在子宮內更有效地誘導蛻膜形成，進而促進胚胎著床。
為了探究TRs在不同位置、植入前後的區別，作者首先使用單細胞 mRNA 測序（scRNA-seq）數據【2】對E4.5 TE細胞進行分析，發現polar TE和mural TE轉錄組存在明顯差異（圖1）。Polar TE中調節TR自我更新的TFs（Cdx2、Esrrb和Elf5）、Wnt配體Wnt7b和BMP1/4/8b和受體Il6st增加；調節TR增殖的通路和基因上調，包括MAPK通路（Fgfr1、Mapk1、Map2k1、Grb2和Spry2）和增殖機器（Cdk1、Ccnb1-2、Ccnd1、Mki67和Pcna）；SMAD信號通路的效應子（E2f4、Smad3、Smad4和Smad7），以及調節Cdx2的Hippo通路成員（Amot、Lats2、Ywhab和Wwc1）和靶標（Max、Myc和Ccnd1）也上調。這些數據表明，STAT、SMAD和Hippo通路在polar TE中得到了增強。而Mural TE的特徵包括與中間細絲（Krt8/18）和緊密連接（Ocln、Pard3和Pard6b/g）形成相關的分子以及轉錄因子Gata2、Klf4/5/9、Tfap2a和Tcf7l2。隨後，作者比較了TE（E4.5）和ExE（extraembryonic ectoderm, 胚外外胚層，E6.5，植入後）TRs的轉錄組【3】，發現分泌配體Bmp4和Igf2的表達增加，而與胰島素信號傳導相關的基因表達減少。
圖1. Polar TE與Mural TE細胞轉錄組差異分析
接下來，作者探究了滋養層幹細胞（TR stem cells, TSCs）的異質性。通過對CDX2high（CDX2在晚期小鼠囊胚中標記polar TE）和CDX2low TSCs進行RNA-seq，鑑定了1941個差異表達基因。CDX2high TSCs中富集了調控自我更新的TFs（Esrrb、Eomes和Eif5）、細胞週期組分、Hippo通路和一些極性標誌物（Ly6a和Ddah1）；相反，CDX2low TSCs高表達分化標誌物Krt8和Gata2。通過scRNA-seq分析來描述TSC的異質性，顯示TSCs存在三個亞群（cluaster3、4和5）：Cluster 4富集了TE相關基因，包括與上皮細胞相關的基因（Cldn4/6、Krt18、Epcam、Ctnna1、Lgals9、Krt8/18和Itga6）；Cluster 3富集了ExE基因（Eomes、Elf5、Hand1、Tead2、Id1、Cited2和Bmp4）；Cluster 5基本沒有TE和ExE基因，反映了更多分化的TRs。因此，TSCs包含3個亞群：滋養外胚層、胚外外胚層和分化的滋養層。這些TSCs亞群反映了功能不同且可互換的幹細胞狀態：CDX2high細胞存在於細胞週期的所有階段，而CDX2low細胞主要存在於G0/G1期；CDX2high細胞的致克隆率是CDX2low細胞的3倍，CDX2low細胞在去除FGF4/TGFb1後更容易分化；在CDX2high或CDX2low細胞分選後5天內，這些亞群重新建立了初始異質性。
進一步，作者通過檢測EPI分泌因子在TSCs中誘導CDX2的能力，篩選到一組可誘導產生穩定的CDX2high TSCs的最優分子（EPI誘導劑）：FGF4（25 ng/mL）、TGFb1（2 ng/mL）、Activin（50 ng/mL）、IL11（50 ng/mL）、BMP7（25 ng/mL）、8-Br cAMP（200 nM）、LPA（5 nM）（簡稱 TXV）。在TXV中培養TSCs（1）增強了它們與 TE 的轉錄組相似性；（2）增強了自我更新；（3）抑制了與分化相關的基因表達；（4）保持了其快速分化和嵌合ExE的潛力；（5）具有增強的潛力來複刻TE上皮形態發生的特徵。因此，作者將這些細胞稱為滋養外胚層幹細胞（trophectoderm stem cells, TESCs）。隨後，作者發現EPI誘導劑可局部作用於TE polar-mural axis，TESCs具有更強的形成blastoids的能力。
最後，作者探究了EPI誘導劑與蛻膜形成之間的聯繫。在初始附著（~E4.5-5.0）之後，囊胚指示子宮形成蛻膜組織（~E5.0-7.5），但來自不同TRs庫的貢獻尚不清楚【4】。與TSCs相比，由TESCs或CDX2i-TSCs（CDX2誘導轉基因-TSCs）形成的blastoids具有增強的蛻膜化能力，它們形成與囊胚大小相似的蛻膜，表明EPI誘導劑有助於TE進行蛻膜化。用GW501516（PPARd受體激動劑，賦予TE植入能力）處理blastoids，將降低CDX2表達及蛻膜化的可能性，表明CDX2表達賦予TR對子宮組織蛻膜化的能力。隨後，作者試圖鑑定（1）其分泌受CDX2調節的分子和（2）可能有助於蛻膜化的分子。通過SCENIC計算框架分析，預測了多個 Wnt 配體（Wnt6 和 Wnt7b）和受體（Fzd2/7/10），其啟動子區域可能與CDX2結合。在囊胚中，Wnt7b轉錄本最豐富，其次是Wnt6。WNT7B在TE及其衍生物中高表達，Wnt6/7b表達在ExE中保持。由Wnt6或Wnt7b KO TESCs形成的blastoids最初附著在子宮上，與野生型相當（E5.5），但發育至E7.5時，蛻膜的大小顯著減小。這些數據表明，EPI誘導劑不僅維持了局部TR增殖和自我更新，而且促進了WNT6/7B的分泌，刺激子宮蛻膜，有利於胚胎植入。
總的來說，該研究提供了一個框架來解釋胎體如何利用誘導和 TR 狀態波動來維持祖細胞、促進分化或分配和平衡植入發生所需的功能（圖2）。作者表明EPI誘導劑的特定組合增加了TF網絡（CDX2，EOMES和ESRRB）的最優性，增強了自我更新，並防止了分化。而對誘導劑的次優暴露有利於祖細胞狀態的波動，從而產生具有促進分化的可逆亞群。這種EPI/TR界面的動態調節賦予祖細胞池一種靈活的策略，以維持更多的祖細胞或產生分化的細胞類型。該研究也存在一定的侷限性：（1）由TESCs形成的胚層植入子宮並有效地形成了蛻膜，但並沒有觀察到胎兒的形成，尚未滿足發育的最低要求；（2）基於TSCs中RNA-seq、ChIP、TESC和CDX2過表達分析，以及這些基因在人囊胚TE中的表達模式，選取了WNT6和WNT7b作為CDX2的下游效應子。然而，蛻膜化是一個涉及多個參與者的複雜過程，除了 WNT6/7b，胎體分泌的其他分子也可能會影響蛻膜化。
圖2
原文鏈接:
https://doi.org/10.1016/j.stem.2022.06.002
參考文獻
1. Cha, J., Sun, X., and Dey, S.K. (2012). Mechanisms of implantation: strategies for successful pregnancy. Nature Medicine 18, 1754-1767.
2. Nakamura, T., Yabuta, Y., Okamoto, I., Aramaki, S., Yokobayashi, S., Kurimoto, K., Sekiguchi, K., Nakagawa, M., Yamamoto, T., and Saitou, M. (2015). SC3-seq: a method for highly parallel and quantitative measurement of single-cell gene expression. Nucleic Acids Research 43, e60.
3. Posfai, E., Schell, J.P., Janiszewski, A., Rovic, I., Murray, A., Bradshaw, B., Yamakawa, T., Pardon, T., El Bakkali, M., Talon, I., et al. (2021). Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nat. Cell Biol. 23, 49-60.
4. Rivron, N.C., Frias-Aldeguer, J., Vrij, E.J., Boisset, J.C., Korving, J., Vivie, J., Truckenmuller, R.K., van Oudenaarden, A., van Blitterswijk, C.A., and Geijsen, N. (2018). Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature 557, 106-111.
