前言

銀屑病關節炎（PsA）與許多免疫細胞群的發病機制有關，目前已知PsA與CD8+T細胞（尤其是產生IL-17）有關。本篇研究通過質譜流式細胞術（CyTOF）結合轉錄組學技術，測量PsA、SF和血白細胞的高維數據集，並鑑定炎性蛋白（骨橋蛋白和CCL2）。無任何體外刺激條件下定量分析SF蛋白，以確定髓源性介質在PsA發病機制中的作用。

2021年12月,由英國牛津大學納菲爾德骨科、風溼病學和肌肉骨骼學院Nicole Yager、Paul Bowness教授課題組在國際風溼病頂級期刊Annals Of The Rheumatic Diseases期刊（IF:27.973）發表了題為 “Ex vivo mass cytometry analysis reveals a profound myeloid proinflammatory signature in psoriatic arthritis synovial fluid”的研究成果，通過質譜流式細胞術和轉錄組學研究方法，發現了骨橋蛋白和CCL2的特徵，探究了PsA的炎症機理，描繪了PsA SF和血液的綜合細胞圖譜。為PsA診斷和治療提供了理論依據。

研究思路

研究方法

1、實驗分組/研究材料

（1）實驗組：11名（6名男性，5名女性，未接受生物DMARDS或類固醇治療的連續患者，4名甲氨蝶呤治療的患者）採集血液和SF；其中3名患者進行PCR陣列評估，3名患者進行scRNA測序，另外3名患者進行靶向SF和血漿蛋白分析

（2）對照組：15名健康者（10名男性，5名女性）採集血液

2、技術路線

2.1細胞因子染色和分析: Maxpar、ConsensusClusterPlus和FlowSOM法

2.2 PCR陣列：RNeasy Micro kit（Qiagen）、定製384基因陣列（RT2）、ΔΔCt方法計算SF血樣

2.3 定量骨橋蛋白：LEGENDplex、人骨橋蛋白ELISA

2.4 scRNA測序分析：Seurat識別分析聚髓細胞簇

3、統計分析

Benjamini-Hochberg、Wilcox、BioLegend

研究結果

1. 與PsA血相比，PsA SF顯示特異性髓細胞量顯著增加

對11名PsA患者的SF和血液進行細胞因子分析，通過主成分分析（PCA）可顯著區分PsA、SF樣品與血液（圖1）。無偏聚類算法FlowSOM觀察到細胞間的明顯差異。在PsA SF中，中間體單核細胞、巨噬細胞、cDC1、cDC2、CD206+cDC2、pDC、記憶CD8 T細胞、記憶CD4T細胞和CD56bright NK細胞顯著增加；非經典單核細胞、嗜鹼性粒細胞、初始CD8 T細胞、初始 CD4 T細胞、B細胞、CD56dim CD16+NK細胞和NKT細胞則顯著減少（圖2）。

圖1 | PsA滑液（SF）、血液的實驗流程和主成分分析

圖2 | PsA SF CyTOF分析細胞組群適應性

11例PsA患者中有4例服用甲氨蝶呤，對單核細胞或巨噬細胞沒有影響，而cDc1、CD206+cDC2及CD56dim CD16+NK細胞增加，激活的記憶性CD8 T細胞減少。與血液相比，甲氨蝶呤並不影響PsA SF的總體升高/降低。將健康血液與PsA血液進行比較，發現PsA血液中pDC和MAIT細胞的頻率降低(補充圖S1)。

2. PsA SF中擴展多個記憶T細胞亞群

與血液相比，PsA SF中PD1hi記憶CD4 T細胞，PD1mid記憶CD4 T細胞、CD25hi記憶CD4 T細胞、CD49a+記憶CD8 T細胞群顯著增加，並採用FlowSOM對細胞群聚類分析（補充圖S2）。

3. PsA SF髓樣細胞在體外孵育時自發釋放促炎蛋白

體外孵育SF和PsA患者的血液，並將匹配的樣品進行比較。除了18種細胞表面譜系標記物，還包括18種細胞內標記物以檢測細胞因子、趨化因子和其他分泌蛋白，包括IFNg、IL-4、IL-10、IL-17和IL-21（主要由T細胞分泌）以及IL-8、CCL2、CXCL10、骨激活素和骨橋蛋白（主要為髓樣細胞）。採用FlowSOM對細胞群進行聚類分析，在經典單核細胞、中間單核細胞和巨噬細胞的SF中，骨橋蛋白、CCL2和IL-8在T6時均顯著增加。PsA血液中，由於中間單核細胞太少，無法分析單核細胞（圖3A、補充圖S3A-3B、S6和補充表S3）。

PsA SF中的 CD11c+CD14 + CD123- 細胞在6小時內產生了骨橋蛋白、CCL2和IL-8。但在血液中僅檢測到少量骨橋蛋白，SF單核細胞中CCL2和IL-8顯著高於血單核細胞（圖3C-D），SF單核細胞中產生較高的CXCL10和骨化素（補充圖S7）。T細胞因子在6小時期間釋放的信息發現，SF MAIT細胞中IL-10的表達增加了95%（補充圖S5）。選用PMA /離子型黴素作為陽性對照，顯示了T細胞的召回能力和產生細胞因子的能力（補充圖S8）。

圖3 | PsA SF單核細胞/巨噬細胞在離體6小時內自發產生骨橋蛋白、CCL2和IL-8（CXCL8）

4. 與匹配的PBMCs相比，SPP1和CCL2在SF T細胞和單核細胞的基因表達中均上調

從匹配的PBMC和SF樣本中提取CD14 +細胞、記憶CD8 T細胞和記憶CD4 T細胞，三種細胞類型與血液相比，發現SF失調的基因表達上調（圖4B）。在SF CD14 +細胞中，骨橋蛋白基因SPP1是上調最高的基因。CD14+細胞中CCL2和CXCL10同時上調，但CXCL8 （IL-8基因）未上調。CyTOF數據集中，儘管OLR1和TNF顯著上調，但相應的蛋白沒有顯著增加（圖4C）。

PsA PBMCs中的基因表達與對照樣本比對（補充圖S9A）。SPP1和CCL2僅在PsA SF與PsA血中上調，而在PsA血中和健康血中無顯著差異。與健康血液相比，PsA SF中CXCL10 IL上調，但在PsA血中下調（補充圖S9B）。與血漿相比，SF中骨橋蛋白、CCL2和IL-8均富集（圖4D）。對血液和SF的單核/巨噬細胞簇，進行差異基因表達分析，發現SPP1上調最多。SF中的SPP1和CCL2均在多個細胞群中表達，但表達水平相對較低。CyTOF數據中，SF的單核/巨噬細胞群體的細胞因子、趨化因子基因上調最高（圖5）。

圖4 | 分析PsA SF CD14+細胞、記憶CD8+T細胞和記憶CD4+T細胞基因

圖5 | PsA SFMC的scRNA測序數據中，單核細胞/巨噬細胞中骨橋蛋白和CCL2基因高度上調

通過基因水平證實，在新分類的PsA SF CD14單核細胞/巨噬細胞和scRNAseq數據集中的單核細胞/巨噬細胞的SPP1（骨橋蛋白的基因）上調最高。SF T細胞中，CyTOF沒有檢測到骨橋蛋白，而骨橋SF CD4 T細胞中也沒有CXCL13。PsA單核細胞/巨噬細胞產生了IL-8（CXCL8），但血液中的含量高於SF，說明滑膜組織細胞或中性粒細胞可能是PsA的主要來源。

研究結論

通過質譜流式細胞術（CyTOF）結合轉錄組學分析技術，發現在沒有任何體外刺激的情況下，經典單核細胞、中間單核細胞和巨噬細胞會自發產生大量的促炎介質骨橋蛋白和CCL2。基因表達分析PsA 單核細胞/巨噬細胞，發現基因顯著上調的骨橋蛋白和CCL2，且這兩種蛋白質在PsA SF中也顯著升高。生成的PsA SF和血液的綜合細胞圖譜，揭示了PsA 中具有潛在致病性和治療重要性的關鍵骨髓促炎模塊。

小鹿推薦

質譜流式細胞術結合組學分析技術揭示了銀屑病關節炎滑液中的骨髓促炎特徵，生成的PsA SF、血液白細胞高維數據圖譜，體外識別了淋巴和骨髓細胞因子。研究分析，單核細胞/巨噬細胞的抑制療法，是引發PsA炎症的因素之一；骨橋蛋白和CCL2兩種蛋白對PsA診斷和治療有一定作用。

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（質譜流式細胞術、質譜流式細胞術（CyTOF）、蛋白組組學）

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