撰文 | 亦

髓母細胞瘤（Medulloblastoma, MB）通常由小腦發育異常導致，是一種典型的兒童惡性腫瘤。小腦起源於後腦翼板背側部的菱唇（rhombic lip, RL），這一區域負責產生所有興奮性神經元，而後內化成結節。解剖學上，RL被血管床隔開，劃分為腦室區（ventricular zone, RLVZ）和腦室下層（subventricular zone, RLSVZ）兩部分。

MB涉及的分子亞群有四種，分別是WNT, SHH, 3型（group 3） 和4型（group 4）【1】。其中，WNT MBs 起源於胚胎期背側腦幹的苔蘚纖維神經元，而SHH和3/4型MB則被認為起源於小腦。臨床診斷中，3/4型MB佔65%，核磁共振成像顯示其佔據第四腦室的大部分或全部，因此神經專家很難從解剖學上追蹤其起源。分子水平上，3/4型MB特徵也尚不明晰。儘管發育中小鼠小腦的單細胞圖譜已被刻畫【2,3】，為推斷不同MB亞型起源提供了一定契機。但受限於物種差異性，對於精準疾病模型的構建和臨床治療方案制訂而言，解析人類小腦發育與MB（尤其是3/4型MB）的聯繫需求迫切。

近日，來自聖裘德兒童研究醫院的Paul A. Northcott課題組和西雅圖兒童研究所的Kathleen J. Millen課題組在Nature上發表了題為Unified rhombic lip origins of group 3 and group 4 medulloblastoma的文章，利用多組學技術揭示了人小腦發育過程中髓母細胞瘤亞群的起源，並描述其分子及表型特徵。

作者首先利用人類胎兒（孕後9-21周）小腦的52,419個單細胞及核的轉錄組數據，在bulk水平將MB不同分子亞群分別對應回小腦發育中具體的細胞類型。發現SHH MB與顆粒神經元祖細胞（granule neuron progenitors, GNPs）轉錄組更為接近，3型MB對應人類胚胎RL，4型MB對應RL、穀氨酸能小腦核神經元（glutamatergic cerebellar nuclear neuron）或單級刷細胞（unipolar brush cell）（由於二者很難區分，一般統稱為GlutaCN/UBC）。隨後作者通過擬時序分析，發現3/4型MB細胞與GlutaCN/UBC譜系早期祖細胞擬合得很好，且4型MB細胞分化程度更高。對應地，用小腦單細胞數據去擬合MB亞群，得出的結果也一致。

為了進一步證實3/4型MB與人RL–GlutaCN/UBC譜系之間的關係，作者對7例人類胚胎顯微切割的RL樣本和7例外顆粒層（external granule layer, EGL）樣本（孕後14-21周）進行了甲基化圖譜繪製。EGL作為小腦發育過程中一個短暫的生髮區（germinal zone），富集大量增殖的GNPs。基於甲基化的分類顯示，所有的EGL樣本均被劃分為SHH-MB，RL則指向3型MB，但4型MB的分數很低。以上結論綜合說明3/4型MB與位於RL的GlutaCN/UBC譜系祖細胞對應，且沿此軌跡分化。

隨後，作者引入了人類胚胎小腦亞區（subcompartments）的bulk RNA-seq數據集來進一步完善轉錄組圖譜。研究發現，RLVZ信號富集在處於幹細胞狀態的原始RL細胞中，而RLSVZ信號更多富集在RL–GlutaCN/UBC發育軌跡的祖細胞中。bulk MB表達譜中亞區特異的基因集分析也證實SHH MB顯著富集EGL表達特徵，而3/4型MB顯著富集RLSVZ特徵。與預期一致，另一基因集中也顯示RLSVZ區域UBC顯著富集。

值得注意的是，RLSVZ區域鑑定出與視網膜相關的光受體（photoreceptor）信號。3、4型MB高表達的RLSVZ基因不同，3型MB表達大量經典的光受體標記物（如EYS, GNB3, CRX , RPGRIP1)，4型MB高表達不同的UBC 標記物（如EOMES, BARHL1, DDX31,LMX1A）。43例病人腫瘤的免疫染色結果與基因表達一致，3型MB腫瘤高表達CRX，4型MB腫瘤高表達EOMES，處於中間態的腫瘤二者都表達，但水平相對降低。數十年來，3型MB的光受體表達特徵起源一直不清楚【4-6】。在人類胚胎小腦和MB中，作者都觀察到轉錄因子OTX2與RLSVZ光受體信號表達之間的強相關性。CRISPR–Cas9基因編輯實驗證明，OTX2對於維持3型MB中光受體表達這一特性是必需的，並且能夠抑制MB中谷氨酸能神經元分化。

接下來為了探究3/4型MB的遺傳病理學，作者對324例3/4型MB的體細胞突變註釋進行整合，發現GFI1B 增強子劫持（hijacking）在兩個亞群中都很顯著，這直接導致BARHL1–DDX31 位點（locus）的結構變異。介於3/4型MB中BARHL1–DDX31位點的劫持頻率相同,結合前文其在RLSVZ的基因表達模式也類似，作者認為使用多組學評估更能說明3/4型MB的RL起源問題。綜合CHIP-seq，ATAC-seq，RNA-seq及甲基化水平的評估，研究發現3/4型MB中DDX31轉錄活躍，染色質開放，SHH MB中DDX31大多失活。而在GFI1B激活的 3/4 型MB中，作者在DDX31最後一個內含子4.6kb的窗口內檢測到結構變異，進一步發現RL和EGL的不同甲基化狀態，具體表現為SHH MB和人胚胎EGL樣本相對高甲基化，而3/4型MB和人胚胎RL樣本都呈現去甲基化特徵。

最後，作者分析了小鼠小腦235,331個單細胞的圖譜，發現在任何細胞類型中，都沒有RLSVZ-來源的光受體信號富集。轉錄組分析顯示，小鼠中Eomes主要表達於誕生於RL的處於有絲分裂後期，轉移和成熟的UBCs，而在人腦中，它大量表達於RLSVZ祖細胞而不是分化程度更高的UBCs。以上都說明，小鼠和人的小腦發育在分子水平差異巨大，本研究鑑定出了一些human-specific的特徵。此外，‘small MBs’的核磁共振顯示，不同MB亞型的腫瘤定位也不同。

總的來說，本文揭示了3/4型MB的未知譜系起源，改變了以往人們認為3，4型MB是完全獨立的實體這一認知，描述了其對應的分子信號，細胞狀態，生物途徑途徑和臨床表型，及解剖學診斷位點，為臨床MB（尤其是non-WNT/non-SHH MBs）的風險評估和診斷提供了指導性意見。

在同期，加拿大The Hospital for Sick Children的Michael D. Taylor團隊在Nature上發表了背靠背文章Failure of human rhombic lip differentiation underlies medulloblastoma formation，同樣也揭示了菱唇分化在MB中的重要作用。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05208-9

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05215-w

參考文獻

1. Northcott, P. A. et al. Medulloblastoma. Nat. Rev. Dis. Primers 5, 11 (2019).

2. Hovestadt, V. et al. Resolving medulloblastoma cellular architecture by single-cellgenomics. Nature 572, 74–79 (2019).

3. Vladoiu, M. C. et al. Childhood cerebellar tumours mirror conserved fetal transcriptionalprograms. Nature 572, 67–73 (2019).

4. Cho, Y. J. et al. Integrative genomic analysis of medulloblastoma identifies a molecular subgroup that drives poor clinical outcome. J. Clin. Oncol. 29, 1424–1430 (2011).

5. Kool, M. et al. Integrated genomics identifies five medulloblastoma subtypes with distinct genetic profiles, pathway signatures and clinicopathological features. PLoS One 3,e3088 (2008).

6. Northcott, P. A. et al. Medulloblastoma comprises four distinct molecular variants. J. Clin. Oncol. 29, 1408–1414 (2011).