相信做過質粒構建的同學應該都很容易看明白shRNA的設計過程，如果還不懂的，可以參考以下兩篇文章看看：

1. shRNA序列設計：從載體結構到設計操作案例

2. 知識分享：手把手教你設計shRNA

隨便插個圖，裝的高逼格一點↑

看完之後，我來給大家分享一下這兩天設計shRNA時遇到的一個疑難雜症（或許是因為我基礎差的緣故），一個特殊內切酶BsaI引起的困惑！

起初，我認為是單酶切，然後隔壁老張也說了單酶切的缺陷：沒有方向。再然後我就蒙圈了.......難不成那麼多文獻裡面報道的方法裡面給的shRNA序列都錯了？雖說都是低分的期刊，但是我相信還不至於那麼多不靠譜的研究者都出現了同樣的錯誤。雖然最近很忙，但是我還是想硬剛一下。於是我開始四處尋醫，問了好些人後，最終從代理商那得到倫理一個關鍵資訊：BsaI單酶切竟然TMD能起到雙酶切的效果！大牛們請原諒我的大驚小怪... 接下來我詳細記錄一下此次過程，便於將來有需要的小夥伴參考。

裝逼×2↑

我們要設計的是一個靶向人PROK1的shRNA，根據最上面連結中的方法得到的序列（5'-3'）如下：

CCGG CTCCATGGACTTGAAGAACATCTCGAGATGTTCTTCAAGTCCATGGAG TTTTTTG，其中CCGG的內切酶AgeI的酶切位點（識別並切割A^CCGGT）；下劃線為最終發揮靶向目的基因作用的特異性siRNA序列；加粗字型為莖環（loop）序列，注意這個莖環序列有點個性，本身也能反向互補，看著也挺迷惑人的；CTCGAG後面的則是與siRNA反向互補的序列；最後的TTTTTTG是為了保證shRNA轉錄出來後其末端有連續的4個U而設計的。

如果粘性末端設計為CCGG，那麼必須要求質粒上有能被識別並且留下粘性末端為CCGG的酶切位點，據我所知也就是AgeI了：A^CCGGT。然鵝...我們現有的質粒上並沒有！只有BsaI酶切位點！而且，很多文獻中報道的粘性末端也不是CCGG，而是CACC，但是人家卻是聲稱用的是BsaI單酶切。這是咋回事？我再次仔細看了BsaI的酶切特點，結果發現，它的識別序列和切割序列原來是兩個概念！即，識別序列為：GGTCTC；切割序列為：GGTCTCN^NNNN，N為任意鹼基。如下圖所示：

因此，我們可以推測，已發表文獻中CACC不是雙酶切後留下的粘性末端，而是BsaI單酶切產生的效果，也就是說上圖中切掉的那四個N正是CACC。同樣，另外一端留下來的粘性也是該質粒特異性的序列。

綜上，在我們這個特殊質粒的情形下，PROK1 shRNA的sense序列應該是下面第一行這樣：

其他的也不多說了，說多了容易錯，裝逼被發現會遭雷劈的。