Anal. Chem.：使用高光譜受激拉曼散射在乳腺活檢中基於鈣化評估腫瘤惡性程度

基於組織鈣化可對乳腺腫瘤惡性程度進行精確評估，這對疾病診斷及瞭解腫瘤發展過程非常關鍵。傳統的X光鉬靶可提供鈣化的整體形態但缺乏化學信息。自發拉曼光譜可提供詳細的化學數據但缺乏空間分佈信息。復旦大學研究人員Yifan Yang等基於光譜和空間域分析，應用高光譜受激拉曼散射（SRS）顯微術來提取微鈣化的化學和形態特徵。成像了23例患者的共211個鈣化點，並用基於支持向量機（SVM）的分類算法對結果進行了分析。通過優化微鈣化的化學及幾何特徵組合，使良性和惡性病例的區分精度能達到98.21%，召回率100.00%，相較基於純光譜學或成像的方法有顯著改善，可實現新鮮組織的快速準確評估。文章以“Microcalcification-Based Tumor Malignancy Evaluation in Fresh BreastBiopsies with Hyperspectral Stimulated Raman Scattering”為題發表於Analytical Chemistry。

背景乳腺癌是女性癌症相關死亡的第二大原因，每年佔所有癌症病例的23%。惡性腫瘤的早期和準確診斷可極大幫助降低發病率和死亡率，減輕患者經濟負擔。目前早期檢測的主要篩查工具是X光鉬靶（X-ray mammography），其中鈣化被認為是瞭解和評估疾病的重要特徵。這些鈣沉積物中包含豐富的化學成分混合物（如磷酸鹽、草酸鹽和碳酸鹽），以及與腫瘤發展和惡性腫瘤密切相關的各種形態信息（大小、形狀和分佈）。然而X光鉬靶僅能提供鈣化的形態學特徵而沒有化學成分信息，並不足以精確評估腫瘤狀態。因此結合乳腺鈣化的化學和組織學特徵的方法對於提高診斷準確性至關重要。基於分子鍵振動的指紋光譜特徵的拉曼光譜可提供卓越的化學識別能力。與用於表徵乳房鈣化的其他光學方法相比，拉曼散射的特點在於揭示內在的組織和生物礦物的化學成分。已經證明根據草酸鈣（CAO）、羥基磷灰石（Hap）和碳酸鹽的光譜特徵，拉曼光譜可區分不同類型乳房鈣化。已知I型鈣化是透明的，由CAO晶體組成，這種鈣化只發現於良性導管囊腫中，癌中很少發現；而II型鈣化是不透明的，主要由鈣Hap組成，鈣Hap存在於良性和惡性疾病中，但Hap中碳酸鹽的丰度顯示與惡性腫瘤呈負相關。此外鈣化中的蛋白質水平也與惡性腫瘤相關。但自發拉曼散射截面成像速度過慢（約每幀一小時），不能提供足夠的被認為與疾病狀態相關的形態學信息。如根據乳腺成像報告和數據系統（BI-RADS），放射技師會將“爆米花樣”鈣化物歸入低風險類別。沒有空間分辨率的情況下，自發拉曼光譜僅能提供關於異質鈣化複合體的空間平均化學信息。為將光譜和空間域信息連接起來，研究人員應用高光譜受激拉曼散射（hyperspectral stimulated Raman scattering, SRS）顯微術來研究微鈣化。作為一種新的化學成像方式，SRS信號強度和成像速度提高了幾個數量級，同時保持了化學分析的不失真譜線形狀。與傳統自發拉曼散射不同，當泵浦（ωp）和斯托克斯脈衝（ωs）同時與鍵振動（頻率Ω）相互作用時，SRS從受激發射過程中得到增益，鍵振動與兩個激光束之間的拍頻共振（Ω = ωp - ωs）。SRS在各研究領域顯示出廣泛的應用潛力，特別是生物和生物醫學研究領域，包括腫瘤的無標記診斷、化學分析、細胞代謝、藥物輸送、生物燃料等。當進一步與機器學習算法結合時，SRS在自動與智能診斷的快速無標記組織學應用方面顯示出巨大成功。雖然已有研究嘗試過用SRS光譜分析在薄組織切片中評估乳房鈣化，但還沒有過將化學和組織病理學信息集成到一起用在腫瘤評估中。另外新鮮組織活檢更適合形態學成像和特徵提取，沒有通常在冷凍組織切片中出現的切片及冷凍偽影。因此對新鮮組織中的微鈣化進行高光譜SRS成像，將為乳腺腫瘤的惡性程度評估提供新思路。本文使用高光譜SRS評估良性和惡性乳腺病變的各種微鈣化中，腫瘤惡性和多維SRS特徵之間的相關性。從新鮮人乳腺活檢樣品中獲取鈣化的指紋SRS光譜（900-1100cm-1）和化學選擇性圖像。使用光譜分析提取檢測窗口內的主要化學成分（Hap、碳酸鹽和蛋白質），處理圖像以提取每個鈣化點的主要形態特徵（幾何和紋理）。最後，利用支持向量機（SVM）對乳腺病變進行分類，通過組合並優化化學和形態學特徵，使分類精度得到顯著提高。結果01-新鮮乳腺活檢的SRS成像全乳X光鉬靶成像後，顯示出了分散鈣化（圖1A左），芯針抽吸可能包含豐富鈣化的病變進行組織活檢。在SRS顯微鏡下，可對不同化學成分進行選擇性成像以揭示其空間分佈。在高頻C-H拉伸區可以看到整個組織的組織病理學（圖1A右），拉曼頻率2845cm-1（CH2拉伸）和2930cm-1（CH3拉伸）處可見脂質（綠色）和蛋白質（藍色）分佈，而在指紋頻率區，962cm-1（白色）處可檢測到乳腺組織內鈣化物（Hap）的分佈。同時採用SHG通道對膠原纖維成像（紅色）。放大的微鈣化部位、細胞區域和結締膠原纖維等細節處可很容易地觀察到乳房組織內的強烈不均勻性（圖1B）。

圖1 乳腺活檢的典型高光譜SRS成像結果。（A）從X光鉬靶區域獲取的活檢樣本多色SRS圖像。（B）圖A三處放大，顯示有鈣化、密集細胞和富含脂質（綠色）、蛋白質（藍色）、膠原纖維（紅色）和Hap（白色）的結締組織區域。（C）乳腺組織、標準BSA和Hap中微鈣化的SRS光譜。除每個特定化學圖像中顯示的空間信息之外，超光譜SRS還可提供任何給定感興趣空間區域的光譜信息。圖1C為具有四個主要拉曼活性峰的鈣化的典型SRS光譜。通過比較純Hap和BSA的SRS光譜，可確定鈣化主要由Hap組成（962cm-1處有代表性的磷脂振動模式），並混合有一定量的蛋白質（1005 cm-1和1032cm-1處的特徵苯丙氨酸環呼吸振動模式）。約1072cm-1處的峰可歸因於磷灰石複合物中嵌入的碳酸鹽（CO32-）的υ1振動模式，與先前的研究一致。已知碳酸鹽取代會影響Hap的拉曼光譜，並且良性和惡性乳腺組織微鈣化物中的碳酸鹽丰度存在差異。這些微鈣化的光譜特徵為基於SRS光譜的化學成分分析奠定了基礎。因為Ⅰ型鈣化僅存在於良性病例中，且檢測頻率窗口（900-1100cm-1）中沒有出現草酸鈣，所以本研究中僅關注Ⅱ型鈣化的診斷價值。為收集和分析大量的微鈣化點，首先需要在新鮮活檢組織中有效地搜索它們。利用單通道SRS以962cm-1成像快速定位富含Hap的鈣化點，圖2展示了良性和惡性組織中嵌入的微鈣化圖像，同時還有脂質、蛋白質和膠原纖維的化學圖像用以說明整個組織結構。這些圖像可能已經顯示出明顯的形態差異，良性鈣化顯得更密集和聚集，而惡性鈣化則顯得更分散，有大量更小的微結構（毛玻璃樣）。在900-1100cm-1光譜範圍內逐一對這些鈣化點進行高光譜SRS掃描。在所有23例患者中，共研究了211個鈣化點（101個良性，110個惡性），含用於定量分析的光譜和形態學信息。

圖2 帶有微鈣化的乳腺組織的典型SRS圖像。A、B為惡性組織，C、D為良性組織。綠色，脂質；藍色，蛋白質；紅色，膠原纖維；白色，Hap。02-微鈣化點的光譜和形態特徵提取首先根據鈣化的SRS光譜分析了其中的化學成分。圖3A為標準BSA、Hap、裸組織以及良性和惡性鈣化的自發拉曼光譜，用以確認峰值分配。良性和惡性鈣化的SRS光譜如圖3B和C。可見每個光譜由四個窄拉曼峰組成，Hap（962cm-1）、Phe 1（1005cm-1）、Phe 2（1032cm-1）和CO32-（1072cm-1），位於寬XPM背景光譜之上。擬合所有上述峰，並提取與腫瘤惡性相關的三種主要化學物質Hap、蛋白質和碳酸鈣的相對丰度。如良性和惡性病例間，蛋白質與Hap（Phe1/Hap）的比率、碳酸鹽與蛋白質（CO32-/Phe 1）的比率有顯著差異（圖3B和C）。良性鈣化中的碳酸鹽含量往往較高，而惡性鈣化中總蛋白質水平似乎更豐富。

圖3 鈣化乳腺組織的自發和受激拉曼光譜分析。（A）標準BSA、Hap、裸組織和良性及惡性乳腺組織鈣化的自發拉曼光譜。（B，C）良性和惡性鈣化的SRS光譜，擬合峰值代表Hap、Phe1、Phe2、CO32和XPM背景。基於Hap的SRS圖像定量表徵了Ⅱ型鈣化的形態學特徵。良性（圖4A）和惡性（圖4B）鈣化的典型強度圖進一步轉換為二值圖像，以提取最相關的幾何特徵，包括圓形度、面積、周長和傅立葉描述子。統計結果表明這些特徵在良性和惡性病例間表現出顯著差異（圖4C和D）。例如，良性鈣化傾向於表現出面積更大、表面更光滑、圓形度更高和傅立葉描述子，與SRS圖像中直接觀察到的一致。X光鉬靶顯示在大鈣化中有類似的特徵，但很難觀察到微鈣化。此外紋理特徵也可以從原始強度圖像中提取（無需二進制轉換），但診斷價值並不高。

圖4 從鈣化的SRS圖像中提取形態學特徵。（A，B）良性和惡性鈣化結果二值化的 SRS圖像。（C，D）所有測量乳房鈣化中提取的兩種形態特徵的統計分佈的箱線圖。03-功能排序和選擇從SRS光譜圖像中提取鈣化點的所有特徵後，包括化學和形態學特徵。Table 1列出了所有18個特徵（2個光譜、8個幾何和8個紋理）。其中一些特徵的區分性較高，如平均面積和化學比率。因此需要選擇信息量最大的特徵，減少冗餘信息，實現最佳計算效率。應用RFE算法對這些特徵進行排序，如Table 1最後一列所示。似乎幾何特徵總體上排名最高，而紋理特徵排名較低。為找出區分乳腺惡行腫瘤的最佳特徵組合，測試了五組特徵進行訓練與驗證，即2F、6F、8F、10F和18F。2F代表兩種化學/光譜特徵。6F代表純幾何特徵，包括排名前五的特徵。8F包含光譜和幾何特徵，均在前八排名內。10F開始包含紋理特徵。18F包含所有特徵。旨在尋找產生最佳評估結果的特徵組合。

04-基於機器學習的微鈣化點SRS評價在上述特徵組合選擇的基礎上，應用SVM對所有實驗數據進行訓練與驗證，以醫院的診斷結果作為基本事實。訓練與驗證數據集以兩種方式進行比較：基於鈣化和基於患者。使用了不同的驗證方法：LOONCV和10倍嵌套交叉驗證，並根據準確性、精確度、召回率和F評分生成結果。訓練和驗證結果如圖5。總體而言，基於患者的數據集結果比基於鈣化的數據集結果更差，表明後者中存在過度擬合，因為同一患者的鈣化數據在訓練集及驗證集之間交叉；因此基於病人的方法更適合。此外LOONCV性能最好，訓練集比10倍方法更大，這特別適合於小規模數據集。此外SVM訓練包含更多的特徵並不一定會產生更高的評估精度。雖然從2F到8F的驗證結果越來越好，但當特徵數進一步增加到10F和18F時，驗證結果通常會下降。詳細觀察表明，純化學特徵（2F）預測結果適中（準確率82.94%；精度85.58%），而純幾何特徵（6F）效果更好（準確率95.26%；精度92.37%），二者的組合（8F）結果最好（準確率99.05%；精度98.21%）（圖5A和B）。圖5C和D顯示了基於鈣化和基於患者的LOONCV結果的ROC曲線，證明當包含化學和幾何特徵時該SVM模型的評估性能近乎完美。

圖5 不同特徵組合的SVM模型評價結果。（A）基於鈣化和（B）基於患者的訓練和驗證結果，包括純化學、純形態學、10倍和LOONCV的組合特徵。每個雷達圖有八個軸：精度、召回率、精確度和訓練與驗證結果的F分數。誤差線以相應的顏色顯示。（C）基於鈣化和（D）基於患者的SVM模型的ROC曲線。純形態特徵和組合組的曲線下面積（AUC）值都達到了同樣的好結果，接近理想值1，這主要是因為它們近100%的高召回率（靈敏度）。意味著兩種模型產生的假陰性事件可以忽略不計。但完整的驗證結果可更全面地評估這些模型，表明組合特徵確實表現最好，尤其是在精度和準確度方面（圖5A和B）。而包含紋理特徵並不能幫助改善驗證結果，可能表明鈣化的紋理與疾病狀態的相關性要小得多。結論本研究發現，整合鈣化的化學和形態學信息可顯著提高乳腺腫瘤惡性評價效果，這也表明微鈣化的化學組成和結構特徵是相互關聯的。鈣沉積的形成過程與鈣化複合體的具體組成有關，進一步由不同疾病狀態的潛在生化性質確定。SRS高光譜成像提取的特徵包含有關鈣化的多維信息，可能會幫助對疾病進行準確分類。未來可側重於將這些SRS特徵以較大規模數據集與不同類型和級別的乳腺腫瘤相關聯，以及開發相應的機器學習算法。利用新鮮的活檢樣本快速評估腫瘤惡性程度對術中診斷有重要實用價值。傳統的組織病理受限於耗時的組織製備程序。SRS無需處理樣本即可提供天然組織的內在分子對比和組織結構，以無標記的方式高速得到化學和形態學信息。光學技術和深度學習算法也不斷推進著超光譜SRS顯微術的發展，這對腫瘤評估中微鈣化的快速分析大有裨益。另外手持式SRS檢測和小型化設備提高了實用性，使該技術有望向臨床轉化。參考文獻：Yifan Yang, Yinlong Yang, etal. Microcalcification Based Tumor Malignancy Evaluation in Fresh Breast Biopsies with Hyperspectral Stimulated Raman Scattering. Analytical Chemistry. 2021,93,15,6223-6231.