全世界每年大約有兩百萬人因肝臟疾病而喪生，每年有3.5%的人因患有肝臟疾病而死。在世界範圍內，肝硬化是11大主要病因之一，並且在今後的世界範圍內，由於它而導致的死亡率和死亡率還會不斷上升（2017年有1320,000多名患者，而在1990年則低於899,000）。

根據病情輕重，慢性肝臟疾病可劃分為四個時期：

(1)肝臟發炎；（2）肝纖維化；（3）肝硬化；(4)晚期肝臟疾病（ESLD）或 HCC （HCC）。這是一種漸進的進程，在此期間，慢性肝病患者或 ESLD患者肝臟的不可挽回損害；目前僅有的一種療法是肝臟移植。目前 OLT手術存在著免疫排斥反應、術後併發症及器官供體不足等問題，需要進一步探討 OLT的新方法。

1976年，首次進行臨床前原代人類肝臟移植，為研究細胞治療提供了新的思路。自那以後，細胞治療在慢性肝臟疾病中得到了迅猛的發展。PHHs作為一種很好的代謝型肝臟疾病的來源，已經在臨床上得到了廣泛的使用。但是， PHHs在體外難以進行擴增，由於其資源十分的限制，因此，必須尋找其他的細胞源。現在已證實，在 I和 II階段的實驗中，幹細胞已經被證實是非常有用的，並且可以用來治癒肝臟纖維化和肝硬化。

目前，在肝臟組織中，利用幹細胞來進行肝纖維化及肝硬化方面的研究是十分困難的。近年來，關於幹細胞治療的有效性、可行性和安全性的研究已經被大量的文獻所報導。然而，由於臨床樣本難以取得，目前對人體肝臟疾病的幹細胞治療僅限於病人。

以前已經將其機理歸納為兩種主要的方法：

(1)在離體條件下，誘導向功能性細胞的直接分化，取代損傷的細胞；

(2)機體中的細胞外分泌及免疫調節素，以調控炎性進程。

在纖維性病變方面，已報告了幹細胞的再生介質（ECM), MMP （MMP）和 TIMP （TIMP）等可促進纖維變性的發生。與常規的方法比較，以幹細胞為基礎的治療方法對病人的侵入程度要小於外科手術，而且也降低了免疫排斥的危險。在此，我們將對近年來在肝臟纖維化及肝硬化方面的應用進行綜述，以期對後續的幹細胞臨床應用有所幫助。

o1肝臟纖維化和肝纖維化的幹細胞研究

在clinicaltrials.gov上，用“肝病”、“幹細胞”等關鍵字進行檢索，結果顯示：160個應用於肝病的臨床實驗，包括末期肝病，肝癌，肝纖維化和肝硬化，75例（47%）用於肝硬化或肝纖維化（不包含已經停止和撤銷的研究）。在75例患者中，大部分研究的重點是 I/II階段（36%)。

用於肝臟纖維變性和肝硬化的登記的有關的臨床實驗。A臨床實驗，按照臨床分期；B各種幹細胞用於當前的臨床實驗；臍血造血幹細胞；BMMSC, MSCs；ADMSC，一種由脂肪衍生的骨髓間充質幹細胞；低密度脂蛋白原核，肝內基質細胞；MenSC，來自血液的 MSC；SHED是從人體掉下來的牙齒中提取出來的；G CSF，粒細胞集落激活劑；BMMNC, BMMNC, EPC, EPC；肝豆狀細胞；C.臨床實驗，按照輸送路徑進行分級。

就細胞治療而言，下面幾點尤其需要注意：細胞類型，細胞數目和施用方式。

在肝臟纖維化和肝硬化方面，有許多不同的細胞，其中最常用的是 MSCs 。目前，在臨床上使用的骨髓，臍帶，脂肪，經血，牙髓，肝等多種器官。而且， Meta研究顯示，來自於骨髓的幹細胞比來自於臍帶的更高效，而且在晚期肝臟疾病（MELD）評分、 ALB、丙氨酸氨基轉化酶（ALT）、 TBil水平以及 TBil水平方面， BMMSC稍好於臍帶基質幹細胞[8]。這是因為 MSCs與其他組織間的結合、移動或迴歸的差別。這些特徵決定了被注射到血液循環中的細胞的宿命，並能夠在受損的位置上增強其自我恢復和免疫的功能。USMSC的粘附和轉移速度要快於 BMMSC，但是 BMMSC的擴散動態優於 USMSC 。而且，現在沒有辦法區分出哪一個更好， UCMSC和 BMMSC更好？其它原因還包括 BMMSC對細菌的殺滅和存活，並與 UCMSC比較，促進/消炎的作用。

先前的一次試驗表明，骨髓間充質幹細胞的移植可以增加 HSC的成活率。加瓦姆扎德等證實， HSC和 MSC聯合移植能增加供者的肝臟細胞取代受者肝臟的比率，並減少肝臟纖維的形成。另外， MSCs在肺中的存活時間較少，並且在肺部有較多的停留。因此，為了獲得更好的療效， MSC必須反覆進行多次的植入。

處理要求1x106以上的細胞。使用的細胞量取決於病人的體重，臨床情況，給藥途徑，以及細胞的種類。對於肝硬化或者肝功能不全的患者，肝細胞的移植是為了給損傷的肝功能的恢復，進而對肝進行修補。根據這個觀念，一般的細胞移植計算的基礎是大約10-15%的肝重量，比肝的新陳代謝障礙要高。最大的注入細胞數量不大於5%的肝臟組織（大約1x1011個）。

由於細胞輸入引起的各種合併症，例如門脈高壓和細胞血栓，使能夠輸入的細胞數目受到限制。肝臟移植不但沒有效果，還會對病人的免疫功能產生一定的影響。局部應用 MSCs可以明顯地減輕肝臟手術後的肝纖維變性。在治療肝臟纖維化及肝硬化時， MSCs的用量明顯少於肝臟，說明 MSCs的主要作用機理不在於治療，而在於其誘導的再生與免疫調控。在低劑量組、中等劑量組和高劑量組中，在安全和最小劑量劑量下，兩組間的療效並無差別。在間歇和反覆多次（比如一星期兩次）中，其療效看起來更加明顯和穩固。

o2幹細胞在肝纖維化/肝硬化中的應用

根據以上的研究結果，我們發現在肝臟纖維化和肝硬化治療方面存在著許多不同的細胞，下面是對這些細胞的具體介紹。

一種潛在的肝纖維化/肝硬化的幹細胞。各種類型的幹細胞可以從臍帶、骨髓、血液、肝臟等多種組織中得到，特別是間充質幹細胞。離體培養的類似於肝臟的細胞核和 EPCs可以作為替代性的細胞源。

臍血造血

UCMSCs是由沃頓的粘液和臍帶血液提供的。常規的獲取方式有兩種：酶解法和外植法。UCMSCs應當根據經認可的 GMP 進行配製。

hUCMSCs能提高 HGF對大鼠肝組織的增殖細胞核（PCNA）、Est-1p42 （p42）的水平，從而提高肝組織的修復能力。另外，在肝臟疾病的小鼠中， hUCMSCs還顯示了良好的抗腫瘤活性和高 Treg活性。利用microRNA-455-3p介導p21激活激酶2 （PAK2）的表達， hUCMSCs的移植可以降低其活性。

骨髓基質細胞

BMMSCs是從 BMMNCs （BMMNCs）中提取的一種新型的 BMMNCs.將 BMMNC在培養皿內進行接種，再將未粘附的細胞除去，即可獲得 BMMSCs。

因為免疫細胞凋亡IL-6、胰島素樣生長因子-2 （IGFBP-2）及抗炎症IL-1受體拮抗劑IL-1Ra (IL-1Ra)，其在損傷的組織中可釋放出保護細胞因子。另外，肝內特異 ECM可使 BMMSCs向肝內轉移，從而使肝纖維化的發生發生改變。

造血幹細胞

造血幹細胞來源於骨髓和血液。HSC是從經皮下或經流式篩選體系從從經骨髓分離的病人中抽取的單核細胞中分離得到的顆粒集落激活素（G-CSF）。另外，從臍帶血液中也能得到 HS。結果顯示： HSC對CD34、CD45、CD133均有明顯的反應。

有兩種從骨髓向肝移植的方式。一種方法是將幹細胞從骨髓中提取出來，再注射到身體裡；一種方法是利用諸如G-CSF之類的細胞素。所有可以調動 BMSCs的藥物都可以被用來處理肝臟纖維化，但是這種效果的提高並不會直接影響到調動的效果。G-CSF將 BMSCs運至損傷的肝臟，並進行修補。但是，近期的隨機臨床研究顯示G-CSF並沒有提高代償性肝硬化病人 MELD得分，這也許與G-CSF的副作用有關。與 BMMSC比較， HSC對肝臟損害的抗炎症及抗氧化性影響較小。HSC在肝損傷修復中的作用是釋放旁分泌素，以促進內源肝細胞的新生，並促進肝內的新生。HSC和其它幹細胞聯合進行 HSC是一種有效的方法，可以用於治療伴有肝臟纖維化或蛋白質不足的頑固性腹水。

肝臟

由於肝臟和膽管上皮細胞可以被看作是相應的特殊幹細胞，因此，關於肝臟幹細胞的界定尚有爭論。目前，在進行臨床研究的肝臟細胞主要為成年或胚胎的肝臟。用膠原蛋白注入法採集肝臟。因為肝臟的特殊性，必須在新的肝臟中存活60%以上，因此必須馬上進行移植或冷藏。

對於肝硬化和肝功能不全的患者，肝細胞的移植是為了給損傷的腫瘤提供基本的功能支撐，併為其重建起到重要的作用。實際上，肝臟移植不但沒有效果，還會對病人的免疫功能產生一定的影響。目前尚無針對肝臟移植的常規免疫抑制劑。大部分研究機構都採取 OLT治療方法，比如聯合他克莫司和單抗。值得注意的是， LPCs是一種能夠向肝臟和膽管上皮細胞分化的雙重能量幹細胞。他們被視為在慢性肝臟損害中扮演重要角色。LPCs在肝臟的修復中具有舉足輕重的作用。近來的一些實驗顯示，在不發生肝損害時，肝和膽管上皮可以互相轉化，從而在不發生肝損害時發生肝前體細胞的情況下進行轉移。

肝狀細胞

不同類型的幹細胞具有良好的肝臟分化潛能，因而肝細胞樣細胞也被應用到了肝纖維化和肝硬化等方面。但是，來自於中胚層的 MSC，卻在等候其能夠沿其內胚層向成熟的肝臟細胞轉變。

研究者將 MSCs和 HLCs兩種療法的效果進行對比；除 MSCs外，兩個組肝功能都得到了較好的治療效果。這會造成從 MSC中獲得的 HLC，其作用與原代的肝臟細胞相比一般受限。其中一種方法提出了一種誘導多能幹細胞（iPSCs）的方法，其效果優於非分化 iPSCs。使用4.0x107次 iPSCs/kg的肝臟細胞療法顯著地降低了大鼠的肝臟功能不全；但是， iPSC等效的劑量並無明顯療效。這說明，胚胎幹細胞或 iPSCs必須首先進行分化，以達到預期的療效。

雖然當前的 UCMSCs為同一種異種，但是在圍生期 MSCs中HLA-G的高水平的表達，使得 UCMSCs在懷孕時能夠適應母親的免疫，並能抑制全部的免疫細胞。UCMSCs的繁殖力在P3代時最大，但在培養過程中，其繁殖速度逐漸下降。UCMSCs可特異的表現出與 NPY等神經元發生有關的基因轉錄，這表明 UCMSCs向神經細胞的誘導分化更為有利，有望用於神經系統的病變。

由於其製備成本低，體外大規模擴增方便，而且沒有任何的道德問題，因此 UCMSCs已被認為是最有前景的治療方法。

與 UCMSCs比較， BMMSCs在中胚層的發育過程中表現出良好的成骨性、軟骨性及脂肪性。一系列與細菌有關的蛋白在 BMMSCs中有大量的表達，而與 MSCs有關的基因則更多地在 UCMSCs中進行。BMMSCs是一種極具潛力的腫瘤細胞，但由於是以侵襲性的方法得到的，且其數目很少，限制了其在醫學上的發展。

ADMSCs對高氧引起的細胞凋亡及氧化脅迫引起的老化有較好的耐受性，而且 ADMSCs的優良的抗血管新生及高級粒酶的活力也使得 ADMSCs在恢復力上優於 BMMSCs 。ADMSCs與 BMMSCs的表達無顯著性差別。ADMSCs的另外一個顯著優勢在於其高的分離成功率和繁殖率。ADMSCs是一種簡便、易於獲取、且不受限於捐獻者的年齡而被廣泛用於再生醫療領域。

LDMSCs與肝細胞的生長狀況密切，尤其是在其能夠表現出與肝組織有關的標記時，而在正常的胚胎中，這種細胞的分佈受到限制。LDMSCs在臨床實驗中尚未得到廣泛應用。

與 BMMSCs比較，未受誘導的 MenSCs可在18個世代中無明顯的染色體變異。MenSCs的繁殖能力比 BMMSCs高2~4倍，30~47個群體在老化之前增加了一倍。但是，值得關注的是，在肝臟疾病的臨床實驗中，採用常規的方法和培養方法是一個重要的問題。目前還沒有完全證實其安全性和效力。

HSC的第一次在血液疾病中得到了廣泛的運用。鑑於其在體外培養方面的應用，維持 HSC自身的再生和非分化的狀況，是當前面臨的一個嚴重的問題。缺乏 HSC與 HLA相配且滿足臨床治療規範的 HSC來源是有限的。由於自身 HSC的製作比較複雜，費用較高，且受細胞數目的制約，因此 HSC更適用於有血友病的人群。

BMMNCs因其含有多種不同的細胞而存在著不同的同一性。BMMNC在臨床實驗中的應用日益廣泛，並未被進一步的研究。BMMSCs的植入能提高肢體的血液循環，但對 BMMNCs無明顯影響[83]。由於 BMMNC的組成比較複雜，其在實際中的使用仍然有一定的模糊性。

EPCs在臨床上的主要侷限性在於 EPCs的數目很小。EPCs是一種人工誘導的方法，由於 EPCs的同一性以及生產技術的限制，限制了 EPCs的應用。

目前， PHHs的主要研究對象為肝實質細胞，但目前 PHHs的發展面臨著許多問題，例如： PHHs在常規的培養基中增殖能力有限，失去原有表型等，並具有一定的離體作用，且難以獲得。

o4肝臟纖維組織中幹細胞的作用機理

肝纖維化的發生與損傷的發生有關，包括肝細胞死亡、免疫細胞浸潤、肝損傷、肌纖維細胞激活、細胞外基質過量沉澱等。我們將會對這5個領域進行更深層次的研究。

幹細胞在肝臟組織中的作用機理。幹細胞是指以細胞為基礎的基質幹細胞，其作用是取代肝細胞的機能，產生大量的細胞因子，從而提高肝臟細胞的抗凋亡、抗氧化、 LESC的增生、降低肝內的巨噬細胞的活性，從而降低肝臟中的星形細胞活性，從而加速其凋亡，其核心是將 ECM分解，從而減緩肝纖維化的發生。

肝臟的再生

幹細胞對肝臟的再生有三種作用：幹細胞向肝臟中的移植轉化為肝臟，產生與血管形成有關的細胞素，從而增強肝臟的再生能力，從而激活宿主體內的細胞增殖訊息途徑。

MSC對肝臟纖維化的免疫調控作用

抗肝臟損害

肝臟的炎症因子、氧化應激產物、凋亡介質、其它因子等都會對肝臟的損害產生一定的作用。骨髓間充質幹細胞具有抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡等作用。

肌肉成纖維細胞的活力

肝纖維化與其發生有很大關係。肌成纖維細胞呈促纖維性和致炎的表型性，其高水平的表達為a- SMA和TIMP-1。在肝纖維化的臨床研究中，抑制肌纖維纖維的形成是一個重要的靶標。

細胞外基質的退化與重構

ECM的過量沉澱及 ECM的溶血能力與肝臟纖維的降解密切相關。ECM的降解與重構被視為扭轉肝纖維化、抑制向肝硬化發展的重要環節。MSC不僅能降低 ECM的沉積，而且還能調節 ECM的重組，從而提高肝組織的纖維變性。

胞外囊的功能機理研究

細胞外囊泡在營養學和旁分泌方面與幹細胞類似，但其作用機理及半衰期各有差異。

o5總結與前景

本文從臨床進展、臨床研究和幹細胞移植等方面綜述了當前臨床應用的幹細胞資源。並對各種類型的幹細胞在臨床上的應用進行了展望。本研究從肝再生、免疫調節、抗肝損傷、抑制肌纖維細胞活性、細胞外基質的分解與重構等五個角度探討了幹細胞在肝組織中的功能。

在研究幹細胞的抗肝纖維化機理時，我們發現，幹細胞的旁分泌是其產生的重要因素。但是，沒有一個應用幹細胞的 EV用於肝纖維化和肝硬化的臨床實驗。這是因為目前還沒有制定出大量 EV和 EV的規範化的檢測手段，而且 EV的劑量和半衰期還不明確。

與傳統的非細胞治療方法相比，以細胞為基礎的藥物前治療成為今後的一個熱點。原位幹細胞或未經過預處理的細胞，其歸巢能力差，移植後存活率低，在體外培養時細胞老化或活性降低，常常不能取得理想的療效。激發細胞激活的生物學微觀和病理學微觀條件等強化手段已經得到了人們的重視。與2 D細胞培養的 MSCs比較，三維球狀細胞具有較好的體外和體內的抗纖維性。

病理學前處理包括缺氧，炎症因子，活性物質，以及與疾病有關的組織或病人的血液。MSC經IFN-伽馬前處理及3D細胞培養後，其細胞的增殖及免疫調控因素均有所提高。