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1 # 用戶6947901696654
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2 # 齊司禮77
(1) 2%CTAB抽提緩衝液在65℃水浴中預熱。
(2)取少量實驗材料(約300mg)置於研缽中,用液氮磨至粉狀;
(3) 加入700ul的2%CTAB抽提緩衝液,輕輕攪動;
(4) 將磨碎液分倒入1.5 ml的滅菌離心管中,磨碎液的高度約佔管的三分之二;
(5)置於65℃的水浴槽或恆溫箱中,每隔10 min輕輕搖動,30~60min後取出;
(6)冷卻2 min後,加入氯仿-異戊醇(24:1)至滿管,劇烈振盪2~3 min(若提取的是總基因組,則不能劇烈震蕩。),使兩者混合均勻;
(7)放入離心機中10 000 rpm離心10 min,與此同時,將600 ul的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中;
(8) 10 000 rpm離心1 min後,移液器輕輕地吸取上清夜,轉入含有異丙醇的離心管內,將離心管慢慢上下搖動30 sec,使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物;
(9)10000 rpm離心1 min後,立即倒掉液體,注意勿將白色DNA沉澱倒出,將離心管倒立於鋪開的紙巾上;
(10)60 sec後,直立離心管,加入720ul的75%乙醇及80 ul 5 M的醋酸鈉,輕輕轉動,用手指彈管尖,使沉澱與管底的DNA塊狀物浮游於液體中;
(11)放置30 min,使DNA塊狀物的不純物溶解;
(12)10000 rpm離心1 min後,倒掉液體,再加入800 ul 75%的乙醇,將DNA再洗 30 min;
(13)10000 rpm離心30 sec後,立即倒掉液體,將離心管倒立於鋪開的紙巾上;數分鐘後,直立離心管,乾燥DNA(自然風乾或用風筒吹乾);
(14)加入50 ul 0.5 × TE(含RNase)緩衝液,使DNA溶解,置於37℃恆溫箱約15 h,使RNA消解;
將植物組織置於2 mL離心管,加入2顆滅菌鋼珠,液氮冷凍,球磨儀研碎;
2 加入800 μL CTAB提取緩衝液,65℃水浴1 h,期間每隔15 min顛倒混勻若干次;
說明:CTAB(十六烷基三甲基溴化銨,Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide),是一種陽離子去汙劑,可溶解細胞膜並能與核酸形成複合物,具有從低離子強度溶液中沉澱核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質和多聚糖形成複合物,只是不能沉澱核酸.通過有機溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類等雜質後加入乙醇沉澱即可使核酸分離出來。