1、退火溫度低於引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值（Tm值=4(G+C) +2(A+T)）為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

2、延伸時間：1min/kb(10kb內）。引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。擴展資料PCR的過程：1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。